免疫7-8,ELISA,凝集实验20150106cyx.pdf

《微生物学与免疫学实验》 本学期的免疫学实验内容 八个实验，四周完成： 1. 抗血清的制备与分离（1） 2. 巨噬细胞的分离与形态观察(1) 3. 抗体的纯化——硫酸铵沉淀（2） 4. 双向琼脂扩散——检测特异性抗体（2） 5. 酶标抗体制备及其提纯（3） 6. 单向琼脂扩散——测抗体效价（3） 7. 酶联免疫吸附试验——ELISA（4） 8. 凝集试验——快速检测（4） 今天的实验内容与要求 • 实验7. 酶联免疫吸附试验（ELISA） • 实验8. 间接凝集试验法检测血清类风湿因子（凝集试验） 要求： • 掌握ELISA的技术原理与操作方法 • 了解检测血清类风湿因子的免疫学快速检测方法—— 凝集试验 今天的上课流程： ① 进行实验7. ELISA 的“封闭”步骤的操作，等待30min ② 讲解约30min ③ 进行实验7. ELISA的一抗加样，孵育等待30min ④ 进行实验8. 凝集试验的操作 ⑤ 进行实验7. ELISA的二抗加样，孵育等待30min ⑥ 进行实验7. ELISA的显色步骤，孵育15min，观察结果 实验7. 双抗体夹心ELISA法检测人血清中 的抗体含量 1. 抗体包被：将羊抗人IgG抗体预先包被于96孔酶标板上，包 被量是100 µl/孔，4℃包被过夜（已完成）； 2. 封闭：每小组领取1个板框，内含1条12孔的板条，在水槽中 甩净孔中液体，加入约400µl PBST洗涤液，注意别溢出，静 置30秒，甩净，扣干。然后，用记号笔标记小组号和孔编号， 每孔加入200 µl的2%小牛血清，放入37 ℃温育30 min ； 1 2 3 4 5 8 9 10 11 12 A 同学 B同学 酶联免疫吸附实验 (enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA) 1. 将抗原或抗体吸附于固相载体表面，并保持其免疫 学活性； 2. 将抗原或抗体进行酶标记，并使酶标产物保持其免 疫学的特异结合活性和酶学的信号放大活性； 3. 利用抗原抗体的特异性免疫反应以及酶的催化活性 进行抗原抗体的定性或定量分析。 ELISA的一般实验步骤 间接ELISA为例 1. 包被 反应产物 ↓ 2. 封闭 （6） ↓ 加入底物 3. 加样（抗原抗体反应） （5） ↓ （4） 4. 加酶（酶标抗体结合） 酶标抗体 ↓ 抗原抗体结合 结合 （3） 5. 显色（加底物） 包被 封闭 ↓ （1） （2） 6. 读值（测定显色反应） 包被（Coating）： 以物理吸附的方式使抗原