4-第九章 方法的建立.pdf

第九章 液相色谱的方法开发 第九章 液相色谱的方法开发 分离方法 分离方法 第一步干什么? 第一步干什么? 想办法得到各种信息 想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样 品的分析方法 品的分析方法 查文献，如CA(化学文摘) 查文献，如CA(化学文摘) 仪器制造商的文献 仪器制造商的文献 对色谱柱有足够的了解 对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己开发方法 掌握分离机理，自己开发方法 充分了解您自己的样品 充分了解您自己的样品 分析时要了解哪方面的情况？ 分析时要了解哪方面的情况？ 灵敏度的要求有多高? 灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用? 分离时要了解哪方面的情况？ 分离时要了解哪方面的情况？ 要分离（即制备）的样品量有多大? 要分离（即制备）的样品量有多大? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 是否需要保持生物活性? 是否需要保持生物活性? 对分离产物纯度的要求有多高? 对分离产物纯度的要求有多高? 纯度或活性的鉴定如何完成? 纯度或活性的鉴定如何完成? 一般的具体步骤 一般的具体步骤 先用一根短的色谱柱 先用一根短的色谱柱 用相对较高的流速 用相对较高的流速 使用尽可能纯度高的标准品 使用尽可能纯度高的标准品 先用高强度的洗脱液 先用高强度的洗脱液 调节k ’ 值改变保留值 请记住 ∶ 调节k ’ 值改变保留值 每次改变一个参数 调节α值改变选择性 调节α值改变选择性 调节柱长度改变柱效及分离速度 调节柱长度改变柱效及分离速度 使用文献方法 使用文献方法 色谱柱填料的种类、品牌是否相同? 色谱柱填料的种类、品牌是否相同? 注意文献方法的流动相 注意文献方法的流动相 是否损害色谱柱? 是否损害色谱柱? 如色谱填料品牌不同，需要调整流动相 如色谱填料品牌不同，需要调整流动相 注意色谱柱的规格：内径、柱长 注意色谱柱的规格：内径、柱长 需要调整流速、进样量 需要调整流速、进样量 注意梯度条件 注意梯度条件 了解系统的滞后体积（梯度） 了解系统的滞后体积（梯度） 色谱方法转换 色谱方法转换 如果没有与文献或要求相近的色谱柱 如果没有与文献或要求相近的色谱柱 转换进样量 转换进样量 D L 2 ( ) 现在 现在 进样量 Load ×Load ( ) 初始 2