PAKAUTO操作说明.doc

GTI血小板自身抗体检测试剂盒 注：，详细步骤请见原始英文使用说明书。 用去离子水稀释10x洗液，Conc. Wash + 9倍体积去离子水。 1.用稀释液SD：1稀释阴阳性对照、病人血清。 血清量 PC 150μl 50μl NC 300μl 100μl Patient serum 300μl 100μl 2.从病人血小板及正常血小板中分离得到血小板扣 A）取由EDTA 抗凝的血样，离心（110-150rcf，10-15min ）,得到富含血小板的血浆（PRP）。 B）将PRP移入一个洁净的多聚丙烯管中，离心（12000rcf, 5-10min），得血小板扣。弃掉血浆。 C）向血小板扣中加入500ul 细胞重悬防腐液（ CRP），用小枪头轻轻吹打混匀。将此血小板悬浊液移入离心管中，用至少500ul CRP洗3次。 D）制备含1-5 x 107血小板的血小板扣：用CRP重悬上步的血小板扣，将血小板的浓度调节为每微升悬液含10000-50000个血小板。 取1ml 此悬液入离心管，离心12000rcf, 5min。（或者直接取10-15ul 体积的血小板扣也可，此量足以制备血小板洗脱液） 3．制备血小板对照 A）向阳性血小板对照（PCP）、阴性血小板对照（NCP）中加入500ul CRP，室温放置至少10分钟使之水化。轻轻混匀后离心12000rcf, 5-10min。吸干液体残留以得到干燥的血小板扣。 注意：最好用新鲜的正常血小板制备正常血小板洗脱液，如果没有新鲜的血小板再用试剂盒中提供的干正常血小板。 4．制备洗脱液 A）在制备洗脱液前要确保血小板已完全沉淀，且不混有残留的CRP。 B）向已制备的血小板扣中加入180ul 洗脱液（ES），枪头吹打混匀，室温放置2分钟。离心12000rcf, 5min。 C）迅速将洗脱液转移到一个干净的离心管中，加180ul BS , 充分混匀，离心12000rcf, 10min。 5．立即进入下一步实验，或将血小板洗脱液放-80度冻存。 注意：切勿稀释血小板洗脱液。 6．向每个微孔内加300ul 用去离子水稀释好的洗液，室温放置5-10分钟。 7．甩干，倒扣于吸水纸上。.用稀释液SD 1：100稀释抗-IgG。 稀释液SD量 抗-IgG量 每次2条 2000μl 20μl 每次6条 6000μl 60μl 11． 取出洗板4次甩干用稀释液SD1：100稀释抗-IgG。 抗-IgG量 每次2条 2000μl 20μl 每次6条 6000μl 60μl 13．除空白孔，每孔加已稀释的抗-IgG 50μ盖膜，37度30分钟. 用0.5ml去离子水溶解1瓶PNPP粉末，然后用底物缓冲液1:100稀释。 SB PNPP 每次2条 4ml 40μl 每次6条 12ml 120μl 15．取出洗板4次甩干除空白孔，每孔加已稀释的PNPP 100μ，室温避光30分钟。实验环境温度必须保持在22-25度 17．加终止液。所有孔加100μ，空白孔加00μl终止液。 405-410nm读值，490nm或630nm为参照波长。 结果判断： 附录2：注意事项： 稀释液SD最好用前分出所需的总量，避免加样器反复取用污染。 实验环境温度必须保持在22-25度。 稀释抗-IgG不能用玻璃或有机玻璃管，应该用塑料管，即聚乙烯管，如1.5管。 切记底物必须用去离子水溶解，用底物缓冲液稀释，不要混淆。底物溶解后，需避光保存，用前稀释。而且一经溶解，只能使用一次。 读数时将板底用纸巾擦干净。 阳性对照阴性对照的OD平均值 阴性对照 阳性对照 洗脱液 ≤0.100（IIb/IIIa孔） ≥1.000 血清 ≤0.160（IIb/IIIa孔） ≥1.400 7．实验完毕，需立即将试剂盒放入4度冰箱