第二十章 毛细管电泳法.pptVIP

对CE的要求： ▲进样机构不存在死体积，能进行精确的进样控制。 ▲需有毛细管清洗机构。 ▲高压电源至少应能输出200μA×25kV的功率。 ▲检测器尽量安装在接地端，优先考虑柱上紫外检测方式。 ▲ 温控范围宽，以0 ℃为界，越宽越好，上限不应低于50 ℃ ，最好能达到65～70 ℃ ，至少能在20～40℃内恒温，恒温精度应小于±0.2 ℃ 。 高压电源一般采用（0~±30）kV连续可调的直流高压电源，电压输出精度应高于1%。电极通常由直径0.5mm~1mm的铂丝制成。电极槽通常是带螺帽的玻璃瓶或塑料瓶（1ml~5ml不等），以便于密封。 仪器必须接地，操作过程中必须注意高压的安全保护。 一、高压电源 二、毛细管 1.尺寸 毛细管尺寸的选择与分离模式和样品有关。自由溶液电泳多选用50或75μm内径的毛细管，分离的有效长度常控制在40～100cm之间。如进行大颗粒如红细胞的分离，则需要内径大于 300μm的毛细管。CGE或CEC的有效长度一般控制在20cm左右。 2.涂层 一般不需涂层处理。大分子化合物分离时，常常需要惰性管壁，以抑制吸附。做CIEF或CGE时，需要涂层毛细管以抑制电渗。在分离中，有时为了加强电渗或改变其方向，也需要涂层毛细管。 3. 清洗 毛细管在使用过程可能被污染，从而影响分析的结果。为使测定具有良好的重现性，毛细管在使用时应经常清洗。 ▲空管通常用 0.l～1mol/L NaOH、水和缓冲液顺序冲洗，各洗5~10min，或增加有机溶剂如甲醇清洗步骤，以除去管中的脂溶性吸附组分。如果怀疑管内壁吸附有蛋白质或其他有机分子，可用0.l～1mol/L的HNO3洗 5～10min，然后再按常规清洗。 ▲两次分析之间，可用运行缓冲液清洗、平衡。 三、进样系统 毛细管通道十分细小，所需样品不过数nl，所以不能采用色谱的进样方式。通过让毛细管与样品溶液直接接触，然后由重力、电场力或其它动力来驱动样品进入管中。进样量可以通过控制驱动力的大小或时间长短来控制。进样系统必须包括动力控制、计时控制、电极槽或毛细管移位控制等机构。 进样方式： ? 电动法 ? 压力法 ? 扩散法 电动进样 当把毛细管的进样端插入样品溶液并加上电场时，组分就会因电迁移和电渗作用而进入管内。 电动进样的控制参数是电场强度E和进样时间t。电场强度E取值多在1～60kv/60cm 之间；进样时间通常在1～10s 之间，有时可达1min或更大。 优点：电动进样对毛细管内的填充介质没有特殊限制，属普适性方法，可实现自动化操作。 缺点：电动进样对离子组分存在偏向，电迁移速度快的进样多，电迁移速度小的少进甚至不进，这会降低分析的准确性和可靠性。 压力进样 也称流动进样，它要求毛细管中的填充介质具有流动性。当毛细管两端置于不同的压力环境中时，管中溶液即能流动，将样品带入。 可用三种方法产生进样动力：正压、负压（管尾抽吸）、重力（虹吸）。 采用压缩空气（气体钢瓶）可实现正压进样，并可与毛细管清洗系统共用，多为商品仪器采用。 优点：压力进样没有偏向问题， 缺点：选择性差，样品及其背景同时被引入 管中，对后续分离可能产生影响。 扩散进样 利用浓度差扩散原理，当将毛细管插入样品溶液时，样品分子因在管口界面存在浓度差而向管内扩散。扩散进样动力属不可控制参数，进样量仅由扩散时间控制。对于利用电动和压力进样的系统，设置电场或压力差为零，即可实现扩散进样。扩散进样时间一般在10～60s。扩散进样对管内介质没有任何限制，属普适性进样方法。 扩散进样具有双向性，在样品分子进入毛细管的同时，区带中的背景物质也向管外扩散，由此可得到畸变程度较小（和背景差别不大）的初始区带，能抑制背景干扰，提高分辨率。扩散与电迁移速度和方向无关，可抑制进样偏向，提高定性定量的可靠性。 四. 检测器 在毛细管电泳中，毛细管柱内径小（通常50μm或75μm)，区带体积小，仅为nl级，区带迁移速度快，这就对检测器提出了很高的要求。 毛细管电泳要求检测方法必须具有很高的灵敏度和很快的相应速度，且不能引起区带扩张。 常用柱上检测法 紫外检测 由于紫外检测器价格便宜，通用性好，石英毛细管柱有良好的紫外透过性，易于实现柱上检测；再加上大多数有机化合物包括蛋白质等生物大分子都含有紫外发色团，所以它是目前应用最广的检测器。但是，由于受毛细管内径的限制，检测灵敏度较低。 固定波长检测器 可变波长检测器 二极管阵列检测器 毛细管检测窗口的制作 现在所用的毛细管大多为熔融石英毛细管，表面涂有聚酰亚胺涂层