四酶及细胞固定化.pptVIP

第四章 酶及微生物细胞的固定化 ;什么是固定化酶？;随着固定化技术的发展，作为固定化的对象不一定是酶，也可以是微生物细胞、植物细胞、动物细胞或细胞器。 此外，固定化生物催化剂的研究还发展到多酶体系的固定化，以及带有ATP、NAD(P)这一类辅酶的复合酶反应系的固定化。;第一节 概述; 二、 固定化的原则 酶催化作用依靠它的高级结构及活性中心，固定化时活性中心的必需基团应避免参加反应； 避免高温、强碱、有机溶剂以及高浓度盐的处理，保护靠氢键、离子键、疏水键等弱键维系的酶蛋白质的高级结构。 尽可能在温和条件下进行固定化反应。 ;三、固定化酶的性质及其影响因素;(二) 固定化后酶性质的变化 1. 酶活性下降： (1)酶活性中心的重要氨基酸与水不溶性载体相结合； (2)当酶与不溶性载体相结合时，它的结构起了变化； (3)酶被结合后虽不失活，但酶与底物的相互作用受到空间位阻。 ;2． 对酶稳定性的影响 操作稳定性提高 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。 对分解酶的稳定性提高。 对变性剂的耐受力升高 原因: 固定化后酶分子与载体多点连接。 酶活力的释放是缓慢的。 抑制自降解，提高了酶稳定性。;;;;四、评价固定化酶的指标;1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。 或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。 2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2） 3. 4. 或称偶联效率，活力保留百分数。 5. 相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力 ;五、 固定化酶的活力测定方法;第二节 固定化酶的制备;;（一） 吸附法---物理吸附法;（一） 吸附法---离子键结合法;(二)共价键结合法;2. 载体活化的方法;A．重氮法;A．重氮法;A．重氮法例;B 叠氮法;将与载体反应的功能基团与各种重氮化剂、烷化剂等反应形成共价键制备固定化酶。 ;C．烷基化反应法;D．硅烷化法;E ．溴化氰法;（三）交联法制备固定化酶; 先将酶吸附在不溶于水的载体上，再用双功能试剂 戊二醛与酶蛋白的氨基之间交联起来，形成酶网包围在 载体表面。 常用载体：硅胶、离子交换树脂。;（四） 包埋法制备固定化酶;酶液;;2 微型胶囊法;以亲水性单体和疏水性单体在表面发生聚合反应将酶包围起来，形成微型胶囊酶。分三步：;A 乳化分散：取含有酶和亲水性单体的水溶液，在不溶于水的有机溶媒中充分乳化。;各类固定化方法的特点比较: ; 第三节 固定化细胞;一 包埋法;二 载体结合法（吸附法）;研究热点——光交联树脂包埋法 ;第四节 固定化原生质体和辅酶;二、原生质体的制备;三、酶解注意要点;四、稳定剂（高渗溶液）要求;五、原生质体细胞活性的检测;六、辅酶固定化;辅酶固定化的方法：;辅酶的固定化;辅酶的固定化;辅酶再生的形式：;第四节 固定化技术的应用;生产果葡糖浆;生产6-APA和抗生素;生产乙醇和啤酒;(二)生产啤酒 利用麦芽汁发酵生产啤酒，实际上是一种特殊类型的酒精发酵。近年来，利用固定化酵母细胞生产啤酒的研究已经很多。 例如，white等人报道了一个利用海藻酸钙凝胶包埋非絮凝性细胞，连续生产啤酒的方法。 Linko等人将酵母细胞固定于海藻酸钙凝胶内，置于填充式柱式反应器内，用于由麦芽汁连续发酵生产啤酒，可维持几个月，其麦芽汁在柱式反应器内的停留时间为2h，啤酒的酒精含量可达到4.5%。 我国上海工业微生物所从1979年起，也开始进行了固定化酵母细胞连续发酵啤酒的研究。;生产氨基酸;生产苹果酸;生产淀粉酶;在实际应用中需要考虑的一些重要因素主要有：(1)用于固定化的载体和试剂的成本；(2)固定化后酶的活力与回收率；(3)操作过程中固定化酶和固定化细胞的稳定性；(4)在长时间使用后，固定化酶或固定化细胞的再生能力。 目前，固定化增殖细胞方面的研究进展很快。可以预期，在不久的将来有可能利用固定化微生物生产氨基酸、多肽、核苷酸、辅酶、乙醇、啤酒、抗生素、酶制剂、有机酸、激素等产品，这将使整个发酵工业和化学工业发生根本性的变革。;固定化酶、固定化细胞反应器;第五节 固定化酶动力学;;固定化对酶反应动力学的影响 ;1、酶分子构相的改变和载体屏障效应;2、 微环境效应—分配效应 ;3、扩散阻力 ;4、外扩散限制的分析及对酶反应动力学的影响 ;5、内扩散限制的分析以及对酶反应动力学的影响 ;5、内扩散限制的分析以及对酶反应动力学的影响 ;5、内扩散限制的分析以及对酶反应动力学的影响 ;本章复习思考题