720005380zh-采用大孔径酰胺键合固定相开发完整糖基化蛋白的高分离度HILIC分离.pdf

[ 应用纪要 ] 采用大孔径酰胺键合固定相开发完整糖基化蛋白的 高分离度HILIC方法 Matthew A. Lauber, Scott A. McCall, Bonnie A. Alden, Pamela C. Iraneta和Stephan M. Koza 沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德) 应用优势 引言 ■ 通过优化固定相(键合相与孔径)、 亲水作用色谱(HILIC)已经作为一种分离强极性化合物的工具得到广泛 离子对、色谱柱增压以及进样方法 应用。事实上，它已经成为一种较为普遍的小分子分离技术。相比之 改善完整蛋白质糖型的HILIC分离。 下，即使HILIC 的分离选择性在某些情况下(如在糖基化蛋白质的表征中) ■ 采用MS兼容的HILIC实现对样品成分 具有很大价值，HILIC在大分子方面的应用仍相对有限。分析蛋白糖基 的详细研究。 的一种标准方法是通过酶或化学方法将其从对应蛋白质中释放出来， 然后采用HILIC进行色谱分离。以经过优化的亚2 µm酰胺键合固定相为 ■ 具备常规反相(RP)分离的正交选择性， 基础的UPLC® 型分离通过提高分离速度与分离度，彻底颠覆了游离蛋白 可增强糖蛋白样品的表征能力。 1-2 糖基的HILIC分离 。尽管游离糖基分析是一种黄金标准方法，但一直以 ■ 通过糖蛋白分离对BEH Amide, 300Å, 来它都需要冗长而繁琐的样品制备技术。虽然最近推出的GlycoWorks™ 1.7 µm糖蛋白分析专用柱固定相进 3 Rapi Fluor-MS™ N-糖分析试剂盒能够弥补多数不足 ，但在有些情况下仍需 行QC测试，确保批次间重现性保持 4-6 7 要研究表征糖基化蛋白的替代方法 ，例如在需要阐明修饰位点时 。 一致。 为了在糖基仍连接在对应蛋白质上时即对其进行补充分析，我们推出 了经优化的HILIC 固定相及相应方法用于分离完整糖蛋白和消化糖蛋白 的糖型。研究采用大孔径(300Å)酰胺键合有机硅(亚乙基桥杂化，BEH)8 固定相和精心开发的方法，实现了对质量范围为10~150 kDa的完整蛋 白质糖型前所未有的出色分离。 沃特世解决方案 ACQUITY UPLC® BEH Amide, 300Å糖蛋白 分析专用柱 糖蛋白性能测试标准品 ACQUITY UPLC H-Class Bio系统 Xevo® G2 QTof质谱仪 关键词 ACQUITY UPLC H-Class Bio系统， BEH Amide 300Å，蛋白糖基， 糖基化蛋白质，糖基化，HILIC 1 [ 应用纪要 ] 实验 样品描述 LC条件 将糖蛋白性能测试标准品(牛核糖核酸酶A和核糖核酸酶 LC 系统： ACQUITY UPLC H-Class Bio 系统 B 的混合物，部件号186008010)与核糖核酸酶B (Sigma 样品温度：