实验三质粒DNA地制备与纯化.pptVIP

实验三 质粒DNA的制备与纯化 　　　质　粒（plasmid） 是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。 常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等 质粒的复制：严紧型复制（1~n个） 　　　　　　　松弛型复制（20个以上） 常用的质粒载体 是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18, pUC19(500~700 　一、实验目的 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒。 　二、实验原理 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性PH，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。 碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。 　二、实验原理 　二、实验原理 三、实验仪器、材料与试剂 （一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅 （二）材料：含pUC19质粒的大肠杆菌、LB液体培养基 （三）试剂： 溶液I 　　作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 溶液II 　　作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。 溶液III 　　作用：酸性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉淀，K＋　　　　　　　可中和DNA 三、实验仪器、材料与试剂 平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 　作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫） 注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。 无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀 TE缓冲液：溶解DNA 　　　　四、实验步骤 * * 1. 裂解细胞 裂解细胞是指通过溶菌酶、去污剂等试剂破裂细胞壁与膜的过程。对于不同的菌要选用不同的方法，通常有煮沸法、非离子型去污剂法、碱性SDS法(简称碱法)等。三种方法比较而言，非离子型去污剂法较温和，适用于抽提10kb左右的质粒；而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈，只能抽提小于10kb的质粒。常用的离子型去污剂是SDS、非离子型去污剂有Triton X-100等。 2．分离 即将质粒DNA和染色体DNA分离。碱法的分离原理如下：大肠杆菌的染色体约有4700kb长，在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双链DNA片段。当溶液的pH调到大于12时双链DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA的双链分离成单链；而超螺旋状态的质粒DNA仅仅是氢键被破坏，并只发生部分双链解离成单链的变化。再当pH调回中性时单链DNA互相缠绕且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺旋的质粒发生复性反应后仍是小分子，通过离心的方法很容易将二者分开，达到分离的目的。 3．纯化 细胞裂解液中的杂质除了染色体DNA外还有各种细胞壁、膜碎片、蛋白质、脂质类物质及RNA。纯化的步骤就是有针对性地将它们去除。RNA可用牛胰Rnase A分解除去。蛋白质可通过酚、酚／氯仿、氯仿／异戊醇，使蛋白质变性剂而除去，同时，氯仿有强烈的溶脂倾向，对于在除去蛋白质的同时去除脂质类杂质很有好处。氯仿还能将微量的、溶于DNA水溶液的酚抽提掉，而微量的酚对于以后的酶切、转化等过程都会产生不利影响。氯仿／异戊醇的蛋白质变性能力较弱，主要用于含酚试剂处理后的抽提。 正确的去除蛋白质杂质的过程应该是酚一酚+氯仿（(1:1)）一氯仿（或氯仿／异戊醇24:1)，处理，根据实验情况也可考虑省略第一或第二步，但切记不可将氯仿（氯仿／异戊醇）的处理步骤省略掉。抽提过程完成后的水溶液中仍有痕量的酚、氯仿等，可用乙醇沉淀的方法将它们除去。用无水乙醇沉淀的特点是能将DNA进行浓缩，且同时也更换了整个缓冲系统，但DNA也有一定的损失。 接含PUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中 ? 370C，190rpm振荡培养过夜 ? 取1.5 ml菌液入1.5ml的dorf管中 10000rpm、离心1min，弃上清，收集菌体 ? 300uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）10min ? 加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体 *