线粒体膜电位检测(JC-1).docVIP

线粒体膜电位检测（JC-1) （DNA断裂）出现之前，一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。 JC-1(5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide)是荧光染料，可作为检测线粒体跨膜电位指示剂。JC-1有单体和多聚体两种存在状态，在低浓度时以单体的形式存在，高浓度时以多聚体形式存在，两者的发射光谱不同，但均可在流式细胞仪绿色（FL-1）通道检测出绿色荧光，JC-1可透过正常细胞膜以单体状态聚集胞内，正常健康线粒体的膜电位（）JC-1依赖于△(的极性被迅速摄入线粒体内，并因浓度增高而在线粒体内荧光；可被流式细胞仪的红色（FL-2）通道检测到，而细胞发生凋亡时，线粒体跨膜电位被去极化，JC-1从线粒体内释放，红光强度减弱，以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光。根椐这一特征检测 ???? ?所需仪器或者试剂 ??????? ?? 流式细胞仪或荧光显微镜、高速离心机、CO2培养箱、微量移液器 ????????? ?1.5m L Microtube、载玻片、盖玻片（荧光显微镜观察需用）、PBS、灭菌去离子水 ??????? ?使用注意事项 1．?? 微量试剂取用前请离心集液。 2． JC-1避光保存及使用。 3．?细胞培养的数量不宜超过1×106，否则细胞会产生自然凋亡影响检测。 4．?对PH变化过于敏感的细胞建议用胎牛血清取代Buffer孵育染色及洗涤，或延长观测时间 5．?流式细胞仪检测线粒体膜电位变化受到多种因素的影响，因诱导剂、细胞株类型，作用时间的不同而荧光强度比例都有不同，因此没有通用标准的补偿设门指南，因此每个试验需设阴性及阳性对照组进行荧光补偿及设门。 6．组织需先制备单细胞悬液或提取纯化线粒体后方可进行检测，可选用凯基细胞悬液制备试剂盒（KGA829）或线粒体提取试剂盒（KGA827）。 ????? ???? 操作方法 1．?? AnnexinV或 Caspase 3活性）证实确有凋亡产生】，收集细胞； 2．?? PBS洗涤细胞二次（离心2000rpm，5min），收集不多于1×106的细胞； 3．?? 100μL 10× Incubation Buffer加900μL灭菌去离子水稀释成1× Incubation Buffer，混匀并预热至37℃； 4．?? 500μL 1× Incubation Buffer，加入1μL JC-1，涡旋混匀配成JC-1工作液； 【因JC-1在水中的溶解度很小，所以可以通过离心的方法（10，000rpm，1min）去除不溶的颗粒，吸取离心后的上清使用，以消除干扰】 5．?? 500μL JC-1工作液将细胞均匀悬浮，37℃，5%CO2的培养箱中孵育15~20min； 6．?? 2000rpm，5min）收集细胞，用1× Incubation Buffer洗两次； 7．?? 500μL 1× Incubation Buffer重新悬浮细胞； 8．?? 显微镜观察或流式细胞仪分析。 ? 荧光显微镜观察 1．?? 荧光显微镜下观察； 2．?? PBS洗涤细胞两次； 滴加100μL JC-1工作液，加盖玻片，37℃，5%CO2的培养箱中孵育15~20min；1× Incubation Buffe洗涤1~2遍；将盖玻片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下观察； 正常细胞：双色滤光片观察则为：绿++ 红++（高绿高红），如在同一滤光片下观察则为黄绿色 凋亡细胞：双色滤光片观察则为：绿++ 红+（高绿低红），?如在同一滤光片下观察则为绿色 ????流式细胞仪分析 用流式细胞仪检测（Ex=488 nm; Em=530 nm）细胞凋亡的情况，绿色荧光通过FITC通道通常为FL1来检测；红色荧光通过PI通道通常为FL2来检测。.正常细胞{FL-1亮,FL-2亮; R1}，凋亡细胞 {FL-1亮, FL-2暗; R2}，设门的位置根椐细胞种类、实验条件等不同而变化，试验需设未经处理的正常细胞为阴性对照组和阳性对照组，根椐阴性和阳性对照组的双参数散点图来设定门的位置。