千里香植物组织培养优化.doc

千里香植物组织培养优化 　　摘 要：千里香为我国较常见的药用植物，有麻醉止痛，消肿解毒等功效。本实验以其新生幼叶及茎段为外植体，通过优化组织培养方法，筛选出适宜千里香生长的培养基体系，其中生长素的种类及含量对外植体的生长具有重要作用，同时，一定浓度的活性炭也可以有效地预防愈伤组织的褐化。经大量试验发现适合千里香生长的培养基为：MS +6-BA2.5mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭0.5g/L；本次实验旨在为千里香的无土大面积栽培提供新的方法和途径，同时也为千里香在分子水平的研究提供无菌材料 关键词：千里香；组织培养；优化；生长素 基金项目：广西高校右江流域特色民族药研究重点实验室（xzdsysyy2015304）；2014年右江民族医学院校级课题 千里香（Murraya paniculata）又名七里香、万里香，为芸香科（Rutaceae）九里香属（Murraya）植物，原名小叶九里香，1978年黄成就将小叶九里香上升为种，更名为千里香[1]。千里香因具有耐旱不耐寒的特性而广泛分布于我国的广西、云南等高海拔温热潮湿地区，植物体为常绿灌木，具有麻醉止痛，活血散瘀等多种功效，是我国较常用的中草药材。国内外学者对千里香的研究较少，且多见于对其化学组份以及药理作用的探索，D.P. Chakraborty等人发现千里香植物体内含有一种新的香豆素抗生素[2]；Yao hua等人从千里香的叶子中提取了两种氧甲基黄酮，具有抗菌消炎作用[3]；闫江红等人利用HPLC法对千里香叶片中黄酮类成分含量进行了测定[4]。人们对该材料进行药理分析的同时，对其组织培养方面以及分子蛋白水平的研究甚少，国内外暂时还没有千里香植物组织培养的相关文献，通过本次实验，旨在为千里香进一步的分子水平以及蛋白水平研究提供无菌材料，提高其实验准确性和成功率，同时，也为植物组织培养技术提供新的方法和途径 1材料采集 于2016年8月选择晴朗天气在广西省百色市境内进行材料的采集，选择生长健壮、污染较少、无病害的千里香植株，采摘带腋芽的茎段、带小叶柄的叶轴以及幼叶作为培养材料 2方法 2.1外植?w处理 将采集的实验材料用无菌水冲洗8min。其中带叶小柄的叶轴和带腋芽的茎段分割成长约1cm的茎段，嫩叶边缘全部剪掉，以便愈伤组织的生长，留下叶子的中心部分，约占原有叶子面积的一半以上 2.2外植体消毒 将预处理好的外植体放入75%的酒精中，消毒8s，然后快速转入10%的次氯酸钠溶液消毒3min，然后用无菌水冲洗2次，再置于0.1%的氯化汞中消毒7min，之后用无菌水冲洗5次，最后将消毒后的外植体放在无菌滤纸上吸干表面水分后接种在胚芽诱导培养基中 2.3培养基配置 诱导芽生长培养基 MS+6-AB2.5mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L琼脂+30g/L蔗糖 增殖培养基 （1）MS+6-AB（1.5、2.0、2.5、3.0）mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L琼脂+30g/L蔗糖+活性炭0.5g/L （2）MS+6-AB2.5mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L琼脂+30g/L蔗糖 （3）MS+6-AB2.5mg/L+NAA0.5mg/L+13g/L琼脂+30g/L蔗糖+活性炭0.5g/L （4）MS+6-AB2.5mg/L+IBA0.1mg/L+13g/L琼脂+30g/L蔗糖+活性炭0.5g/L 2.4愈伤组织培养 初代外植体接种于诱导培养基中，培养条件为温度为26℃，光照16h，黑暗8h，光强为2500lx的培养箱中培养，定期观察和记录外植体的生长及变化 2.5 6-BA浓度梯度试验 将长势一致、诱导良好的外植体分别转入不同浓度的6-AB（1.5、2.0、2.5、3.0）mg/L的MS增殖培养基（1）中培养，每浓度试验10瓶，培养30d 2.6活性炭试验 将诱导良好的外植体分别移至不含活性炭以及含有活性炭的增殖培养基中（2、3增殖培养基），进行抑制褐化实验，每种培养基实验10瓶，培养15d，观察有无活性炭对外植体褐化影响 2.7生长素种类试验 挑选长势好的材料放入含有一定浓度的IBA生长素的培养基中培养（4），每种接种10瓶，周期30d，与其他生长素进行对比 3 结果与分析 3.1 不同6-BA浓度对愈伤组织的影响 6-BA为植物组织培养常用的细胞分裂素，可以有效促进细胞进行分裂，经过查阅相关文献发现植物在组织培养过程中，该生长素的使用含量差异较大，例如林茜等人对四数九里香植物组织进行培养过程中[5]，6-BA增长浓度为1.0mg/L。王小敏等人在两面针的组织培养与快速繁殖中[6]，6--BA的增长浓度为2