实验一 原核生物基因组DNA的制备.pptVIP

实验一 原核生物 基因组DNA的制备 一、实验目的 掌握从细菌中提取基因组DNA的基本原理 熟悉利用试剂盒提取细菌DNA的技术流程 提取卡介苗BCG基因组DNA 二、实验原理 ①裂解细胞 ②除去蛋白质 ③析出DNA CTAB(cetyltriethylammonium bromide，十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，它能与核酸形成复合物，这些复合物在高盐溶液(0.7mol/l NaCl)中可溶并且稳定存在。此时的高盐溶液中除含有CTAB-核酸复合物外，还含有大量的多糖和蛋白。 核酸提纯 (1) 用氯仿先对此高盐溶液进行抽提，大量蛋白和多糖等被从溶液中抽提沉淀出来，而核酸仍留在溶液中；接着可用乙醇或异丙醇将核酸从溶液中沉淀出来，然后用水或TE缓冲液等将核酸溶解。 (2) 降低溶液中盐的浓度(0.3mol/l NaCl)，CTAB与核酸的复合物就会因溶解度降低而沉淀出来，而大部分的蛋白及多糖仍溶于溶液中；通过离心将CTAB-核酸沉淀下来，然后溶解于高盐溶液中。通过氯仿抽提或CsCl离心等方法去除核酸溶液中所有的蛋白和多糖等不纯物，并用核糖核酸酶(RNase)酶解去除RNA。 三、实验材料 卡介苗BCG 细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）DP302 水浴锅、离心机、移液器 试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统提取细菌基因组DNA。 离心吸附柱中采用的硅基质材料为特有新型材料，可高效、专一吸附DNA，最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。 回收的DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建等实验。 四、注意事项 实验中所有的废弃物均要高压灭菌。 五、实验步骤 （1）取细菌培养液1-5ml，10,000rpm，1min，尽量吸净上清。 （2）沉淀中加入180μl溶菌酶溶液（20mg/ml），37℃，60min。 （3）加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。 （4）加入220μl缓冲液GB，振荡15s，70℃，10min，溶液变澄清。瞬时离心以去除管盖内壁的水珠。 （5）加入220μl无水乙醇，充分振荡15s，此时可能会出现絮状沉淀，瞬时离心以去除管盖内壁的水珠。 （6）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm，30s，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 （7）向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD，12,000rpm，30s，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 （8）向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm，30s，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 （9）重复步骤⑧。 （10）将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm，2min，弃废液。将吸附柱CB3室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 （11）吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm，2min，将溶液收集到离心管中。（为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12,000rpm，2min） 五、结果检测 紫外吸收法检测所提取基因组DNA的浓度与纯度； 取少量DNA溶液在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳分离并在核酸紫外检测仪上观察。 少量DNA溶液在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳分离图片 六.思考题 （1）操作第（4）步骤的时候溶液是否变得清亮？ 如果没有，试分析原因及可能对实验结果产生的影响。 （2）试分析漂洗液PW的成分，在第10步骤中，如果漂洗液没有充分晾干，会导致什么样后果？