角膜基质细胞Nrf2-ARE信号通路活化缺陷在圆锥角膜发病中的作用.pdfVIP

摘 要 目的： 探讨正常角膜和圆锥角膜基质细胞中氧化应激水平、Nrf2-ARE 信号通路活 化的区别，及其对角膜基质降解酶表达水平的影响。 方法：1、收集2012 年 11 月至 2013 年 6 月在青岛眼科医院行角膜移植的圆锥角膜 患者的角膜样本，以及供体正常的旁中央角膜样本，用 Dispase 和 collagenase 联合 消化法，组织块分离培养正常角膜和圆锥角膜基质细胞，培养液均为 DMEM/F-12 （含10%胎牛血清），传代限制在P4 以内，采用200μM H2O2 处理模拟氧化应激微 环境。2 、根据实验需要设定不同培养条件，将正常角膜和圆锥角膜基质细胞分为4 组：①正常角膜对照组（HCF-CON ）：正常角膜基质细胞常规培养；②正常角膜氧 化应激组（HCF-H O ）：采用 200μM H O 处理正常角膜基质细胞；③圆锥角膜对 2 2 2 2 照组（KCF-CON ）：圆锥角膜基质细胞常规培养；④圆锥角膜氧化应激组 （KCF-H O ）：采用200μM H O 处理圆锥角膜基质细胞。3、细胞内活性氧自由基 2 2 2 2 （Reactive oxygen species ，ROS ）的活性采用DCFH-DA 荧光底物孵育法检测。4 、 细胞核内 Nrf2 蛋白、Nrf2-ARE 信号通路下游抗氧化蛋白和尿激酶型纤溶酶原激活 物系统表达水平分别采用免疫蛋白印迹（Western blot ）法和实时定量 PCR (Real-time qPCR) 方法进行检测。5、细胞离心沉淀和培养基上清中基质金属蛋白酶（MMPs ） 活性采用明胶酶谱技术检测。 结果：1、正常培养条件下，圆锥角膜基质细胞中ROS 荧光强于正常角膜基质细胞； 经体外氧化应激刺激后，两组 ROS 荧光强度均有增强，但圆锥角膜基质细胞中 ROS 荧光强度明显强于正常角膜基质细胞。2 、正常培养条件下，圆锥角膜基质细胞核 内Nrf2 蛋白表达水平明显高于正常角膜基质细胞（t=18.155, P ＜0.01 ）；在H2O2 处 理条件下，正常角膜基质细胞 Nrf2 核转位表达水平明显增高（t=50.867, P ＜0.01 ）， 但圆锥角膜基质细胞 Nrf2 核转位表达水平受到抑制（t=62.123, P ＜0.01 ）。3、正常 培养条件下，圆锥角膜基质细胞抗氧化基因还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化 还原酶 1 （NQO-1 ）、血红素氧合酶 1 （HO-1 ）、超氧化物歧化酶2 （SOD2）mRNA 表达和蛋白表达水平显著低于正常角膜基质细胞，差异均有统计学意义（NQO-1: 万方数据 t=9.315, P ＜0.01 ；HO-1: t=13.555, P ＜0.01 ；SOD2: t=7.379, P ＜0.01 ）。在H O 处理 2 2 条件下，Nrf2-ARE 信号通路下游基因 NQO-1 、HO-1 、SOD2 表达量未见明显变化 （NQO-1 ：t=2.209, P=0.092 ；HO-1 ：t=0.293, P=0.784 ；SOD2：t=0.749, P=0.495 ）。 4 、在任何处理条件下，圆锥角膜基质细胞尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA ）、uPA 受体 （uPAR ）表达量和 MMP-2 活性均明显高于正常细胞 （uPA ：t=19.164，P ＜0.01 ； uPAR ：t=15.458，P ＜0.01 ； MMP-2 ：t=4.818 ，P ＜0.01 ）。 结论：圆锥角膜基质细胞在 Nrf2-ARE 信号通路活化方面存在缺陷，且这种缺陷与 其表达基质降解酶的水平密切相关，说明该通路异常可能是圆锥角膜发病的机制之 一。