13-14年秋季分子生物学实验（1-2）修改.docVIP

实验一 从cDNA文库和克隆质粒中扩增靶片段 第一部分 准备实验 一、介绍实验室的规章制度、注意事项 二、准备实验 分组，分发实验服、试验用具 讲解注意点：戴手套操作 准备枪头：装盒，灭菌 各个型号的EP管和PCR管的灭菌 双蒸水灭菌 洗净培养皿、摇菌小三角瓶、试剂瓶等 第二部分 利用PCR技术从特定质粒中扩增靶片段 一、实验目的 通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。 二、实验原理 一）引物的设计： PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。 ???我们可以归纳十条PCR引物的设计原则： ?1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。2.避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。3.长度?寡核苷酸引物长度为1530bp，一般为2027mer。引物的有效长度：Ln=（G+C）+（A+T，Ln值不能大于，因为时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74)，不能保证产物的特异性。4.G+C含量?G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。5.碱基础随机分布?引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。6.引物自身?引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。7.引物之间?两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。8.引物的3′端?引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，3′应尽量避免A或T，3′的A/T往往会大大降低扩增的特异性。9.引物的5′端?引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入启动子序列等。10.密码子的简并?如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。随着人们对引物的认识，一些引物的计算机设计程序也应运而生， 二） PCR原理与体系 PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下： PCR循环过程中有三种不同的事件发生： （1）模板变性；（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。 1． 变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。 2． 退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。 3． 延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。 上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。 典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。 三） 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 DNA分子在高于等电点的pH??溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，具有不同分子量的DNA片段迁移速度不一样， 迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。凝胶电泳不