通过快速定点突变表征人源含硒单链抗体酶的底物结合部位.pdfVIP

V01．3l 高等学校化学学报 No．3 2010年3月 CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES 502～506 通过快速定点突变表征人源含硒 单链抗体酶的底物结合部位 宋健1”，徐俊杰3…，魏景艳3，于扬3，孙卫国3，张桂荣2 (1．吉林大学电子科学与工程学院，2．白求恩医学院，3．药学院，长春130021； 4．吉林医药学院基础医学院，吉林132013) 摘要为了对人源含硒单链抗体酶Se．scFv．B3的底物结合部位和催化基团进行研究，在理论预测的基础上， 通过快速定点突变法分别在2个理论预测的底物结合部位(位点l和位点2)内选定Alal80和Ala44定点突 变为丝氨酸(Ser)．2个突变体蛋白经化学修饰将$er转变成谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的催化基团硒代半 点l可能是主要的底物结合部位，与理论预测的结果一致． 关键词快速定点突变；人源含硒单链抗体酶；底物结合部位 中图分类号0629．7；Q5ll文献标识码A 谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是生物体内一种重要的抗氧化酶，且具有潜在的药用价值，因此开发 GPX模拟物，不但可以使其成为治疗和预防多种疾病的药物，而且对阐明GPX的催化机理具有重要意 义．一系列的小分子GPX模拟物被成功制备¨“J．但这类小分子GPX模拟物活性低，降低了它与底物 的结合能力．抗体酶技术是制备具有底物结合位点的酶模拟物的一个有效途径，大多数催化抗体是基 于PaulingL5o的过渡态理论，以过渡态类似物作为抗原制备的．但是天然GPX的催化反应很复杂，过渡 态不清楚，很难应用过渡态类似物法制备模拟GPX的抗体酶．文献[6]作者采用疏水修饰法，将修饰 后的底物类似物作为半抗原制备单克隆抗体，获得的抗体不仅可以和底物特异性结合，而且具有类似 于天然酶的活性中心的疏水腔；再利用化学修饰的方法在其中引入催化基团Sec．应用该理论，一系列 GPX归J，并表现出了较高的GPX活性．但由于它们是鼠源抗体，在治疗过程中将会引起免疫排斥反 应‘10,11]． 在原核表达系统中实现了可溶性表达，表达的人源单链抗体经化学突变引入催化基团Sec后，具备了 1288 催化抗体以及天然GPX(5780 2|．鉴于人源含硒单链抗体Se—scFv—B3分子量小且具有人源 U／灿m01)∞，J 性等特点，我们将人源抗GSH单链抗体B3的理论预测结果¨纠与分子生物学实验验证相结合，确定其 可能的底物结合位点和关键氨基酸，寻找其转化成GPX催化抗体后活力较低的原因和可能的改造方 案，为后续的研究奠定了基础． 1 实验部分 1．1菌种、载体与试剂 E．coli Ecoli 收稿日期：2009-05-14． No．3 宋健等：通过快速定点突变表征人源合硒单链抗体酶的底物结合部位 503 物由上海生物工程有限公司合成；耽和印n 购自大连TaKaRa公司；分离纯化介质购自PharmaciaBiotech公司；其余普通化学试剂均为国产分析 纯． 1．2 seFv-113基因的定点突变及A44S和A1踟S的引入 使用MiniBEST质粒纯化试剂盒，从保存的E A180S的寡聚核苷酸引物扩增，引入突变位点． 2种突变体所用引物(下划线表示引起突变的碱基替换)如下： PCR反应体系(50峥L)：PCRbuffer(10倍)5斗L，dNTP(2,．5mmoL／L)2ILL，质粒pPELB．scFv．B3 (50 p,L，Primers(100ns／曲)各1．25灿，Pfu 39灿． ng／灿)O．5 1止，ddH20 DNA一严e啪e PCR反应条件：95℃，2min；95℃，30 min及4℃进行18次循环． s；55℃，1min；68℃，11 Opn