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蛋白质组学 浙江大学 生命科学学院 江 辉 第三章 生物质谱技术 基质辅助激光解吸电离技术MALDI(Matrix-assisted laser desorption/ionization) MALDI(Matrix-assisted laser desorption/ionization) MALDI MALDI MALDI是以激光脉冲照射在固定于平面电极上的蛋白质分子，经平行电场加速，在由质谱仪进行分析。以波长337nm的氮气激光脉冲（此波长不会被蛋白质中的芳香环状分子所吸收，避免蛋白质碎裂）击打固定于基质上的蛋白质分子，使得蛋白质从基质上游离並帶上微弱的正电荷。此时再经由高能平行电场加速提高核质比，进入质谱仪进行分析，此方式能分析帶电量低的分子，以及含有許多不同种类分子的混合物。 通常MALDI都会配上TOF（time of flight）分析器。 MALDI使用的基质有很多种，主要的三种为 : α-cyano-4-hydroxycinnamic acid （?-氰基-4-羟基肉桂酸） 2,5-dihydroxybenzoic acid （2，5-二羟基苯甲酸） sinapinic acid（芥子酸） 其中α-cyano-4-hydroxycinnamic acid是最常用的基质。 常用的 MALDI matrices at 337 nm(N2) MALDI 用激光轰击样品使其离子化。 样品先与能够吸收紫外波长的基质混合 （sinapinic acid for proteins, 4-hydroxycinnaminic acid for peptides） 激光波长与基质的最大吸收波长相同，在这个波长下，基质将本身的一部分能量传递给样品。 MALDI Ionization 基质发色团吸收紫外激光，电离。 基质分裂，电荷转移到分析物分子上 。 在超声波的作用下基质膨胀，分析物被膨胀的基质捕获。 MALDI 与ESI不同，MALDI 产生的分子离子只带一个电荷。 正离子检测方式：M + H 负离子检测方式：M - H 比ESI方法有效 （tolerates salts and nonvolatile components） 容易使用与维护 样品的需求量 10 μL ，浓度 1 pmol/μL MALDI Sample Limits 磷酸盐缓冲液 50 mM 重碳酸铵 30 mM Tris buffer 100 mM 胍 (盐酸盐, 硫酸盐) 1 M Triton 0.1% SDS 0.01% 碱金属盐 1 M 甘油 1% MALDI 基质应具有的特性 能够嵌入样品分子间并能起到隔离样品分子之间的相互作用（如形成共结晶）； 能溶解于可溶解样品分子的溶剂； 在真空状态下是稳定的； 可吸收激光，既与激光形成共振吸收； 可激发样品分子离子化。 样品引入方式 直接进样 优点： a) 快速获得分子量的信息； b) 快速获得混合肽的肽谱。 缺点: a) 金属离子干扰, Na, K； b) 离子源结构复杂； c) 没有LC/MALDI 接口； d) 实现MS/MS 困难； e) 需要基质 质量范围 分子量小于500,000 Da Comparison of ESI and MALDI 分析器 分析器 在蛋白质组学研究中，目前有三种分析仪（analyzer）搭配ESI/ MALDI source使用，分別是： triple quadrupole（三级四极杆） ion trap（离子肼） quadrupole-time of flight（四极杆-飞行时间） 质量分析器 空间串联质谱仪 优点： a) 高重现性(稳定性)； b) 最好定性分析工具； c) 可以实现高分辨； d) 高灵敏度； e) 宽的动态范围； f) 可以实现多级质谱的串联； g) 高能collision-induced dissociation (CID) 谱重现性好。 缺点: a) 不能较好的与脉冲离子化技术联用(如: MALDI)； b) 造价高，体积大； c) 联动扫描MS/MS谱的分辨率低。 应用: a) 所有的有机质谱分析方法； b) 精确质量测量； c) 定量分析； d) 同位素丰度比的测量。 飞行时间质谱仪(Time-of-flight mass spectrometer) 质谱法结合数据库检索对蛋白质进行鉴定 肽质量指纹图谱（Peptide Mass Fingerprinting, PMF）法鉴定蛋白质 每个蛋白质经过酶解成为长短不一的肽段后，同一时间获得所有