生物样品的制备.pptxVIP

第二章 生物样品的制备 ;生物样品处理的主要问题：;生物样品预处理的基本原则： 步骤少、时间短，获得尽可能多的目标组分 通常包括以下考虑因素： 确定要处理的生物分子的目的和要求 掌握目标产物的物理、化学以及生物学性质 生物材料的破碎和预处理 分离纯化方案的选择和探索 评价生物分子纯度的检验方法 产物的浓缩、干燥和保存 ;物理、化学及生物学性质的考虑： 1、水溶液和各种有机溶剂中的溶解性 2、不同温度、pH值和各种缓冲液中的稳定性 3、对温度、含水量和冻干时的稳定性 4、分子的大小、带电的情况、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的扩散系数等 5、对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性等 6、对其他生物分子的特殊亲和力 7、组织及细胞内的定位分布等 ;真核细胞的亚细胞器：（a）动物细胞；（b）植物细胞 ;2.2 激光捕获显微切割技术 （laser-capture microdissection，LCM）;A：大鼠子宫上皮H E-染色的冰冻切片样品 B：人空肠Cy2-Ab抗Cytokeratin上皮细胞冰冻切片样品 C：石腊包埋H E-染色的前列腺样品 D：人血液中Giemsa-染色的白细胞样品 E：大鼠小神经元细胞Nissl-染色的样品 F：小鼠HistoGene-染色的肾小球冰冻切片样品 ;2.3 细胞的破碎 ;细胞破碎方法;一、水溶液提取： 稀盐和缓冲溶液对蛋白质等生物大分子的稳定性好、溶解度大。考虑的影响因素如下： 1、盐浓度（即离子强度）：在低离子强度的溶液中绝大多数蛋白质和酶都有较大的溶解度，此为“盐溶”现象；中性盐的浓度增加至一定时，蛋白质的溶解度又逐渐下降，直至沉淀析出，称为“盐析”现象。 ;2、pH值：蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH值密切相关，一般提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内（pH=6～8），通常选择在偏离等电点的pH条件。例如胰蛋白酶为碱性蛋白质，常用稀酸提取。 3、温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时一般在0～5℃的低温操作。;4、防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：可采用加入抑制剂或调节提取液的pH、离子强度或极性等方法使这些水解酶失去活性。例如在提取DNA时加入EDTA络合Mg2+ 使DNAase失活。 5、搅拌与氧化：采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等物质的氧化变性失活。在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸可以防止肽链上的巯基的氧化。 ;二、有机溶剂提取 一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和较强的亲脂性，因此常用来提取与脂结合较牢或含非极性侧链较多的蛋白质、酶和脂类。 有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中。采用稀的有机溶液提取常常可以避免水解酶的破坏。 ;例：胰岛素的溶剂提取 胰岛素可溶于稀酸、稀碱和稀醇溶液，但组织样品中共存的糜蛋白酶对胰岛素有极高的水解活性，因而采用6.8％乙醇溶液并用草酸调溶液的pH为2.5～3.0，进行提取，因为： ①乙醇可以使糜蛋白酶暂时失活 ②草酸可以除去激活糜蛋白酶的Ca++ ③pH 2.5～3.0下糜蛋白酶活性低 以上条件对胰岛素的溶解和稳定性都没有影响，还可同时除去一部分在稀醇与稀酸中不溶解的杂蛋白。 ; 由于样品可含有数千种乃至上万种生物分子同处于一个体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的一劳永逸的分离程序，但很多基本手段是相同的。为了避免盲目性，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验。 常用的分离纯化方法和技术有：离心法、沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等）、透析法、色谱法、等电聚焦制备电泳法等。 ;一、离心分离 1、利用离心作用将目标组分依据密度不同进行分离的技术 2、相对离心力，RCF（重力加速度的倍数） 离心半径10 cm，转速 40000 r/min时的RCF可达200000 g！ 3、沉降系数，Swedberg单位，单位离心力作用下的沉降速度 4、等密度离心法，用梯度溶液形成密度梯度，粒子或分子从离心管顶部进入与其等密度的位置时不受力；甚至可分离RNA和DNA 5、用以收集细胞，细胞器，生物大分子等 6、分离条件温和，但是温度需要控制 ;二、等电点沉淀法 等电点沉淀法是利用蛋白具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。 由于许多蛋