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γ―分泌酶抑制剂对体外培养糖尿病大鼠血管平滑肌细胞Notch信号通路相关蛋白表达影响 　　[摘要] 目的 探讨γ-分泌酶抑制剂（DAPT）对体外培养糖尿病（DM）大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）Notch信号通路相关蛋白表达的影响。 方法 体外培养DM大鼠VSMCs，随机分为两组：正常培养基组（con组）、加入不同浓度（0.15、2.50、7.50 μmol/L）DAPT的培养基组（实验组），72 h后收集细胞，分别用双向电泳方法和Western blot法检测Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白的表达。 结果 ①双向电泳图谱证实提取的蛋白中含有目的蛋白。②Western blot检测结果显示：随DAPT浓度的增加，Nocth1、Nocth3、Nocth4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4各蛋白的表达均递减；7.50 μmol/L组与对con组比较，差异有高度统计学意义（P 0.05）。 结论 DAPT作用于体外培养的DM大鼠VSMCs后，使其Notch信号通路相关蛋白表达减少，在一定浓度范围内（1.25～7.50 μmol/L）呈浓度依赖性 [关键词] Notch信号通路；γ-分泌酶抑制剂；血管平滑肌细胞；双向电泳 [中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）02（c）-0024-04 糖尿病足（DF）是糖尿病（DM）的慢性并发症之一，是高血糖、周围血管病变、周围神经病变等多种因素共同所致，病因复杂，致残、致死率高，治疗费用高。目前针对DF及微血管病变的治疗效果难以令人满意。Notch信号通路具有促进非DM动物缺血区血管新生、动静脉分化等作用。本课题通过γ-分泌酶抑制剂（DAPT）干预体外培养的DM大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs），研究对Notch信号通路中Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白表达的影响 1 材料与方法 1.1 实验材料 冻存的DM大鼠VSMCs（SPF级SD大鼠购自大连医科大学动物实验中心，质量合格证号：0003546，经DM大鼠模型建立、取材后冻存）[1] 1.2 主要试剂和仪器 DAPT（美国Sellect公司）；全自动凝胶电泳图像分析系统（日本Olympus公司）；Mini-Protean 3电泳系统、Mini Trans-Blot转移系统（北航图像中心）；蛋白浓度测定试剂、β-actin（美国Sigma公司）；兔抗Notch1单克隆抗体、兔抗Notch3单克隆抗体、兔抗Notch4单克隆抗体、仓鼠抗大鼠Jagged-1蛋白（JAG1）?慰寺】固濉⒉质罂勾笫?Jagged-2蛋白（JAG2）单克隆抗体、仓鼠抗大鼠DLL4蛋白单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；Bio-Lyte载体两性电解质、IEF电泳槽、IPG预制胶条（美国BioRad公司） 1.3 细胞培养 取冻存的DM大鼠VSMCs进行细胞复苏，将其接种于96孔板，D-Hank′s液冲洗2遍，加入0.25%TRYPSIN+0.02% EDTA4Na约3 mL进行消化，制成单细胞悬液。按1∶2传代培养，传至3代后，随机分为两组：正常培养基（con）组和加入DAPT的培养基（实验）组（浓度梯度分别为0.15、1.25、7.50 μmol/L），继续培养传至6代 1.4 方法 1.4.1 蛋白提取 取配置好的单细胞悬液，加入预冷的细胞裂解液400 mL，冰浴静置40 min，提取蛋白 1.4.2 双向电泳检测目标蛋白 在198 mm×256 mm×1 mm SDS凝胶上，标记纵横坐标，将目的蛋白加入坐标原点，进行第一向等电聚焦电泳，聚焦结束后的胶条经平衡处理后立即进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，取出凝胶，拍照，应用计算机软件分析处理。取提取的蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，计算上样量。煮沸，变性，标记，上样检测或于-80℃保存 1.4.3 Western blot 检测蛋白表达情况 取30 μg蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，加入抗Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4单克隆抗体（1∶200），4℃孵育过夜，加入二抗IgG（1∶5000稀释），室温孵育1 h，ECL试剂盒显影，以β-actin为内参进行数据标准化，以对照组为参照样本，计算Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白的相对表达水平。实验重复3次 1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件进行数据