乙型肝炎病毒耐药检测探究进展.doc

乙型肝炎病毒耐药检测探究进展 　　[摘 要] 核苷（酸）类似物（NA）是目前临床治疗乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染的首选方案，但随着治疗时间的延长，HBV耐药性的产生极易对治疗效果造成影响。HBV耐药性检测包括基因型耐药和表型耐药分析两种手段，其中前者可明确HBV基因组中已知与耐药相关的病毒变异，在近年来病毒耐药性检测领域受到了广泛关注。本文就HBV耐药原因以及DNA直接测序技术、焦磷酸测序技术等十余种基因型耐药检测方案进行综述，旨在为强化HBV耐药管理提供参考 [关键词] 乙型肝炎病毒；耐药；检测；进展 中图分类号：R446 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2017）01-025-03 DOI：10.11876/mimt201701010 据世界卫生组织（WHO）统计，目前全球乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）慢性感染者为3.5亿，其中30%患者已进展至肝硬化阶段，需及时实施长期、有效的抗病毒治疗[1]。干扰素和核苷（酸）类似物（NA）两大类抗病毒药物是目前临床治疗HBV感染的主要药物，其中，NA以其服用方便、安全性高、抑制病毒复制作用明确等优势，得到了广泛应用[2]。但其缺陷在于，需长期服用方可将HBV抑制在较低水平，降低肝硬化、肝癌等继发疾病发生风险，而长期服用NA可诱导HBV耐药突变的发生，加之近年来低耐药屏障NA序贯应用的逐步推广，HBV多药耐药为临床治疗带来了更为严峻的挑战[3-4]。本文就HBV耐药机制、耐药检测及防治策略进行综述，旨在为HBV耐药的监测与分析提供参考 1 HBV耐药原因 1.1 HBV耐药机制 缺乏校正的逆转录伴随着HBV复制的全过程，若HBV基因突变位点恰好处于HBV-DNA聚合酶的逆转录区域，则极有可能导致耐药性的产生[5]。应用抗病毒药物治疗前，慢性乙肝患者体内往往并不存在耐药株，均为野生株，但抗病毒药物对HBV的选择性作用，可逐渐导致药物敏感野生株逐渐减少、耐药株获得生存，继而成为优势病种株，最终引发HBV总体耐药性的产生[6] 1.2 HBV耐药因素 研究表明，药物的空间结构、基因屏障及药代动力学特征均在耐药性的产生环节扮演了重要角色[7]。如拉米夫定与三磷酸脱氧胞苷（dCTP）结构差异明显，但阿德福韦酯与dCTP十分接近，故前者更易发生HBV耐药。Lee等[8]发现，拉米夫定、阿德福韦酯、替比夫定在发生耐药变异时，HBV耐药株仅1个位点发生突变，而恩替卡韦耐药株需在上述突变基础上发生3个位点联合突变，故初治患者恩替卡韦耐药率极低。若抗病毒药物可同时强烈抑制野生株、耐药株复制，则其药代动力学优势可保证HBV处于较低的耐药性。除抗病毒药物自身因素外，患者HBV-DNA定量、病程、年龄、依从性、治疗方案、病情等基础状态亦可对HBV耐药性造成明显影响[9] 1.3 HBV耐药分类 HBV耐药包括基因耐药、交叉耐药两种类型，其中基因耐药即为HBV基因序列发生耐药相关基因突变，若该基因突变导致病毒株对药物敏感性降至野生株的25%以下，则被称为表型耐药；交叉耐药是指病毒在发生基因耐药的同时，不仅对某一种药物耐药，且同时对另外一种无关药物存在耐药性。目前临床常用抗病毒药物的耐药性分别为：拉米夫定20%～69%，阿德福韦酯11%～29%，恩替卡韦9%，替比福定2%～4%，随用药时间的延长，其耐药性不断增加[10] 2 HBV耐药检测 2.1 DNA直接测序技术 DNA直接测序技术是最为经典的HBV耐药检测方法，在所有耐药变异检测技术中，DNA直接测序技术的准确性、特异性均处于较高水平，且多数学者均将该技术作为检测其他技术功效的对比标准[11]。但由于该技术耗时久、经济性差、技术落后、检出限高达20%，且易出现混合感染中少量HBV感染的漏检，近年来应用逐渐减少 2.2 焦磷酸测序技术 焦磷酸测序在DNA直接测序技术的基础上发展而来，是借助DNA合成过程中释放的焦磷酸判断HBV耐药情况的新型酶级联二代测序技术，与过往Sanger法ddNTP参与的链终止反应相比，该技术不需电泳、荧光标记，且分析快速、灵敏度高，可实现自动化定量分析。有学者将该技术用于HBV突变质粒标准品的检测，发现该技术10 min即可完成接近100份样本的检测，且检出限低至4%[12]。但其不足之处在于阅读长度仅为40 bp，覆盖范围有限，故罗氏最新研发的454 GS FLX测序平台在该技术的基础上进一步优化，提供了超深度焦磷酸测序技术，将其阅读长度延伸至250 bp，?z出限进一步升至1%，其高灵敏度、特有基因频率分析功能得到了广泛认可，但同时也大大增加了设备成本以及数据复杂性，临床推