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凝胶层析柱特性分析 （实验报告） 实验日期：2015年4月21日 实验温度：室温 实验地点：生物化学与遗传学实验室 指导老师：****** 班级：2013级生物技术1班 姓名：***** 学号：****** I. 实验目的 1.掌握凝胶层析柱的基本原理； 2.学习凝胶层析柱的操作技术； 3.了解凝胶层析柱的应用。 II. 实验原理 凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。把含有不同大小分子的混合液，铺加在胶面上，让它流过凝胶柱。由于凝胶具有网络结构，当混合液通过凝胶颗粒缝隙中时，溶液中的溶质凡是比网孔小的分子，都能自由进入颗粒内部，而比网孔大的分子则不能进入。因此，在洗脱过程中，大分子物质必然先于小分子物质向下移行，先流出的是大分子物质，小分子物质后流出，从而达到分离的目的。 在凝胶层析中，凝胶粒子间隙的外水相当于移动相，粒子内水相当于固定相。当溶质随洗脱液自上向下移动时，溶质在内水之间连续不断达成分配平衡。相对分子质量大的因不易渗入凝胶孔内，分配系数较小，用较少的洗脱液就能从柱中洗脱出来；反之，相对分子质量小的因渗入凝胶孔内，分配系数较大，需较多的洗脱液才能从柱中洗脱出来。 为了精确地衡量混合物中某一被分离成分在一定的凝胶柱内的洗脱行为，常采用分配系数Kd来衡量，Kd的定义为： 式中 Ve ——某一成分的洗脱体积，即从加入样品算起， 到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积； Vo ——层析柱内凝胶凝胶颗粒之间空隙的总体积， 又称凝胶外水体积； Vi ——层析柱内部微孔的总体积，亦称为内水体积。 洗脱体积Ve与Vo及Vi之间的关系可表示为： Ve=Vo+KdVi 当某种成分的Kd值为0时，意味着这种成分完全被排阻于凝胶建立的微孔之外而最先洗脱出来，即Ve=Vo。可以用一个已知相对分子质量远远超过凝胶排阻极限的有色分子如常用蓝色葡聚糖-2000溶液通过柱床，可测出柱床的外水体积Vo。 当另一种成分的Kd=1时，意味着这一成分完全不被排阻，它可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，在洗脱过程中它将最后流出柱外，Ve=Vo+Vi。 处于上述极端情况（即分子最大与最小）之间的那些分子，它们Kd值在大于0小于1的范围内。由此可见，Kd值得大小序列决定了被分离物质流出层析柱的顺序。Kd只与被分离物质分子的大小和凝胶孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关。 将凝胶装柱后，柱床总体积Vt是三种体积的总和，即凝胶颗粒外水体积Vo、凝胶颗粒内部的体积Vi和干凝胶颗粒体积Vg之和：Vt=Vo+Vi+Vg。 Vt可从柱的直径d和高度h计算：1/4πd2h。 用有效分配系数（Kav）代替Kd，其定义为： 本实验使用蓝色葡聚糖凝胶Sephadex G-50，其适用的相对分子质量范围在500～～III. 实验试剂与仪器 1.实验试剂 Sephadex G-50，蓝色葡聚糖-2000，细胞色素C，铁氰化钾K3[Fe(CN)6]，洗脱液Tris-HCl（0.05mol/L pH 7.5）。 2.实验器材 层析玻璃管（1cm×20cm），试管，烧杯，注射器，滴管、微量移液器，玻璃棒等。 IV. 实验操作步骤 1. 凝胶称取50mL 蒸馏水中，用倾除去细颗粒洗3～次细颗粒Tris-HCl（pH 7.5）洗脱洗涤后，将凝胶保存在洗脱液内。 2. 装柱～ 3. 加样 用洗脱液分别配成6mg/mL的 蓝色葡聚糖-2000、8mg/mL的细胞色素C、5mg/mL的铁氰化钾三种溶液，然后三种溶液等体积混匀，取0.18mL混合液上样。先用滴管吸去凝胶床上面大部分液体，打开出口使洗脱液恰好流到床表面为止，关闭出口（打开开关将多余液体放至滤纸，关闭开关加入洗脱液，洗柱调节流速10～ 4. 洗脱～ V. 实验结果分析 1.绘制洗脱曲线： 以洗脱体积为横坐标，洗脱液的颜色强度为纵坐标作洗脱曲线。 洗脱液颜色强度变化表 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 蓝色葡聚糖 + +++ + - - - - - 细胞色素C - - + +++ ++ ++ ++ ++ 铁氰化钾 - - - - - - - - 管号 10 11 12 13 14 15 16 蓝色葡聚糖 - - - - - - 细胞色素C + + - - - - 铁氰化钾 + + +++ ++ + + 2.计算凝胶柱Vt、VoVe和Kav ①每滴0.05mL 每管20滴 未收集部分的体积