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实 验 一 实验时间安排 1. SDS胶制备 2. 样品蛋白质含量测定 3. 电泳 1. 转移电泳、转印膜丽春红染色 2. 蛋白质胶考马斯亮蓝染色分析 3. 膜封闭 4. 加一抗（过夜温浴4℃） 1. 洗膜、考马斯亮蓝染色胶脱色 2. 加酶标二抗（温浴37 ℃ ，1h） 3. 酶切产物纯化 4.洗膜与显示 5.结果分析 实 验 原 理 第一部分： 1. SDS（polyacrylamide gel electrophoresis ） 实 验 原 理 SDS浓度与分离蛋白质范围 实 验 原 理 第一部分：SDS电泳 2、蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同蛋白在不同pH下表现出不同的电荷；为使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，上样前应进行处理，即在样品中加入含有SDS 和β-巯基乙醇的上样缓冲液。经高温处理，使SDS 与蛋白质充分结合，蛋白质完全变性和解聚，形成棒状结构，同时使整个蛋白带上负电荷，电泳时凝胶中所含的SDS负电荷多肽复合物向正极泳动。 实 验 原 理 第一部分：SDS电泳 3. 蛋白样品处于 pH6.8 压缩胶的上层，pH8.8 的分离胶层在下层。由于pH不连续和胶孔径大小不连续，在浓缩胶泳动时，Pro-受阻小，在慢离子（Gly-）和快离子（Cl-）的共同作用下，不同蛋白质可在压缩胶上被压缩成一薄层，使全部蛋白质在进入分离胶前位于同一“起跑线”上；当蛋白质进入分离胶时 ，不同蛋白以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异， 最终达到彼此分开 。 实 验 原 理 第二部分：样品的印迹（转膜） 1. 选择适当的膜并进行预处理： NC膜的预处理： 剪裁与胶大小一致的NC膜，将其浸入1×转移缓冲液浸泡，使NC膜得到彻底浸润，一般5 分钟以上。 PVDF 膜的预处理： 剪裁与胶大小一致的膜泡入甲醇中，约 1-2 分钟。 实 验 原 理 第二部分：样品的印迹（转膜） 2. 电流 1mA-2mA/cm2，通常 200mA/膜，按照 目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间。 实 验 原 理 第三部分：特异抗体与抗原（靶蛋白）结合、显色 转移后的硝酸纤维素膜就称为一个印迹(blot), 用于对蛋白质的进一步检测。封闭后，用针对目的蛋白的特异抗血清（一抗）处理，印迹中只有待研究的目的蛋白质与一抗结合，而其它蛋白质不与一抗结合。 清洗后，再用适当标记的二抗处理（二抗是指抗一抗的抗体），与适当底物溶液反应后即可产生可见区带，指示目的蛋白的位置。 实 验 操 作 一、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS, SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis 1. 胶模准备与灌胶： 取制胶玻板，平板、凹板各一；平板板平置桌面，左右和底部各放一塑料垫条（为防止胶液泄漏，可以在塑料垫条的两面都涂上一层薄薄的凡士林）；然后盖上凹板，底部对齐,左右和底部三侧用夹子夹紧，直立于桌面上。 配分离胶：取一个 250ml 烧杯，加入以下成分: 实 验 操 作 一、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 胶模准备与灌胶： 灌入胶模，至距胶顶约1.5cm；徐徐加入0.5-1ml水覆盖胶顶。室温放置待胶凝聚（约需30分钟），其间配压缩胶。 实 验 操 作 二、 Bradford法蛋白质含量测定： 取7只试管，按以下顺序加入各种试剂： 实 验 操 作 三、电泳样品制备 分别取含100μg、 10μg蛋白质的鼠肝总蛋白总蛋白置入两只1.5ml离心管中，分别加相应体积的4 × SDS电泳上样缓冲液（ 4 × Loading bu