第七章_现代生物学.pptVIP

第七章 现代生物学技术在蛋白质工程中的应用 传统技术：分离纯化技术，如层析技术、电泳技术；蛋白质鉴定技术，如免疫印迹 技术、酶联免疫吸附测定（ELISA） 新技术：对蛋白质进行分析鉴定的蛋白质芯片技术、蛋白指纹图谱技术；用于功能蛋白质筛选的表面展示技术 第一节 表面展示技术 运用 DNA 重组技术在噬菌体、细菌、真菌、病毒等微生物表面呈现外源蛋白或多肽，已在微生物学、分子生物学、疫苗学和生物技术等方面得到了广泛应用。 概念 表面展示技术是利用基因工程手段将外源基因或一组一定长度的随机寡核苷酸片段克隆到特定的表达载体中，使其表达产物与外膜蛋白或噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式呈现在细胞表面或噬菌体表面。 一、噬菌体展示技术 噬菌体展示技术（phage display techniques，PDT）是将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白融合并展示于噬菌体表面的技术（如右图所示）。1985 年 Smith 等首次应用了该技术。 1988年Parmley和Smith将B-Gal表达于噬菌体的表面，并证实该蛋白有生物活性，可以被相应的抗体识别。随后，许多有功能的蛋白都被表达于噬菌体的表面，包括分泌性蛋白(如抗体、生长激素)、细胞内蛋白和酶类，为这些蛋白的基因工程改造奠定了基础。 从理论上讲，任何蛋白只要能够分泌到细菌周质腔均可被表达于噬菌体的表面。 1990年，George等证明噬菌体不会因外源性DNA片段的插入而影响其本身的粘附、侵入及整合。这种带有外源性基因片段的噬菌体感染宿主菌表达出外源性基因产物和PIII的融合体——融合壳蛋白，由于PIII的特殊定位，外源性片段得以在噬菌体表面表达，并同时保持了本身的三维结构和功能，进而使噬菌体成为一个理想的携带工具。 1 原理 具体来讲噬菌体展示技术就是将待筛选基因插入噬菌体信号肽序列与主要衣壳蛋白基因（主要是基因Ⅷ或基因Ⅲ）之间，构成融合蛋白噬菌体库。表达的融合蛋白可以呈现在噬菌体表面，但不影响噬菌体的完整性和活性。 噬菌体展示技术是第一个真正用于体外高通量筛选的方法。其建立基于三个原则： 在衣壳蛋白基因（主要是基因Ⅷ或基因Ⅲ）的 N 端插入外源基因，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，不影响也不干扰噬菌体的生活周期，同时保持了外源蛋白的天然构象，并能被相应的抗体或受体所识别 。 利用固定于固相支持物的靶分子，采用适当的筛选方法，洗去非特异结合的噬菌体，筛选出目的噬菌体； 外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导出来。 展示文库的特点 富集程度高，由此建立的展示文库的可达106?-1012 位置明确，噬菌体的PIII蛋白定位特殊，定位于噬菌体的尾部，其氨基末端为噬菌体结合F纤毛 噬菌体的衣壳蛋白有很大的可塑性 大部分的蛋白质都可在其表面表达 目前，能用于蛋白质、多肽展示的噬菌体系统有： 丝状噬菌体展示系统 λ 噬菌体展示系统 T4 噬菌体展示系统 T7 噬菌体展示系统 其中，T7 噬菌体系统可以高、中、低拷贝展示不同分子量的蛋白，是目前最为理想的展示系统。 单链丝状噬菌体展示系统 P III 展示系统，主要用于获得高亲和力的克隆，形成单价表面展示体系 P VIII 展示系统，主要用于筛选亲和力较低的克隆，形成多价表面展示体系 P VI 展示系统  T4噬菌体展示系统 其病毒颗粒在宿主细胞内组装，不经过分泌途径，因而其表面展示多肽的范围更广，尤其适用于研究那些不能被大肠杆菌分泌的复杂蛋白质 λ噬菌体展示系统 （同上）可展示有活性的大分子蛋白（100kDa以上）以及对宿主细胞有毒性的蛋白，在后基因组时代前景相当可观 应用的基本原理——（Panning) 将已经建立好的噬菌体文库进行淘选 所谓淘选，是将展示文库作为流动相，而将与欲选择的重组基因产物的特异性的配体（或称靶分子）作为固定相，洗去不能与固定相特异结合的文库大部分成员，将特异结合的成员留下进一步扩增，并反复数轮淘选，即可将无用的基因去掉而将有用的基因富集并分离出来。 2 应用 （1）噬菌体展示技术与蛋白质工程 将编码随机多肽的寡核苷酸克隆到噬菌体展示载体上，构成一个高容量的噬菌体多肽文库时，该文库可用于特异性功能多肽的筛选。同样，利用噬菌体展示 cDNA 文库，可筛选出特定的蛋白质或基因。 （2）噬菌体展示技术与抗体工程 噬菌体展示技术的出现使抗体工程进入第三次革命。噬菌体展示技术的成功应用之一就是噬菌体抗体库构建和单克隆抗体的筛选，利用此项技术可筛选到亲和力和特异性都令人满意的并且修饰过的抗体。 将抗体分子片段与噬菌体外壳蛋