薄层色谱生物自显影技术剖析.pptxVIP

石菖蒲的抗乙酰胆碱酯酶活性成分研究 张旭.薄层色谱自显影跟踪分离天然乙酰胆碱酯酶抑制剂的研究[D].兰州：兰州理工大学，2010：1-62 绪 论 一、引言 二、AD的发病机制及其治疗药物 三、乙酰胆碱酯酶和阿尔茨海默症 四、改进的实验方法的优势 引言 人口老龄化是社会发展的趋势与潮流。面对人口老龄化的世界性难题,老年性疾病的防治是刻不容缓的,这不仅是一个医学问题也是一个社会问题。痴呆症是脑部疾病引起的症状,表现为记忆力、学习能力、方向感、语言表达能力、理解能力和判断力等智力的整体逐渐衰退,它主要困扰着老年人,是造成晚年残疾的主要原因之一。阿尔茨海默病(AD)是造成老年痴呆的最主要原因,是一种进行性和致命性疾病。 AD的发病机制及其治疗药物 AD是以β-淀粉样蛋白沉积的老年斑、异常磷酸化Tau蛋白构成的神经纤维缠结和突触变性、皮质及皮质下神经元变性为特征的脑退行性疾病,其发病机制比较复杂,包括遗传因素、慢性感染、免疫缺陷和环境毒素等多种原因。关于AD发病机制的假说有很多,如胆碱能学说、Aβ（β-淀粉样蛋白）学说、氧化应激学说、Tau蛋白学说、神经血管学说、基因学说等。这其中始于20世纪70年代的胆碱能学说是AD发病机制的最重要假说之一,也是目前绝大多数临床药物的理论依据。另外,20世纪80年代出现的Aβ学说也越来越得到各国学者的认可和推崇。 乙酰胆碱酯酶和阿尔茨海默症 AChE的生物功能： 分为催化功能和非催化功能。催化功能是指AChE的经典功能,即在胆碱能突触处快速水解神经递质ACh,从而终止胆碱能神经信号的传递。非催化功能是指其具有诱导轴突生长和突触形成,参与细胞迁移、粘附和凋亡,促进造血细胞形成和Aβ聚集以及影响炎症和免疫反应等非经典功能。 AChE是中枢胆碱能代谢的重要物质,其活性直接影响脑内兴奋性递质ACh的含量。它在胆碱能突触间快速水解神经递质ACh会加重患者的症状,因此抑制其活性可以间接改善症状。另一方面,促进Aβ聚集的功能和AD密切相关。诱导细胞过度表达会AChE伴随Aβ表达升高,而且诱导Aβ沉积并与之结合形成一种稳定的复合物,比单纯的Aβ更具神经毒性,会造成周围神经元死亡。 乙酰胆碱酯酶和阿尔茨海默症 上述结果表明,AChE不仅和AD的胆碱能系统有关,也参与了AD患者老年斑的形成发展以及神经元的死亡过程,而胆碱能活性下降与AD的老年斑和神经纤维缠结密切相关,二者形成恶性循环,加剧了AD的恶化。目前,增强胆碱能活性仍然是缓解AD症状最有效的方法,因此,寻找活性好、毒性低的AChE仍是开发治疗AD新药的有效途径。 目前用于治疗AD的AchE类药物除石杉碱甲外都是合成药物，如他克林，多奈哌齐等，它们的存在活性不是很强，选择性较低的缺点。目前发现的抗AChE活性较好的化合物多半是生物碱。此外，皂苷、萜类等也有不错的AChE抑制活性。 薄层色谱生物自显影方法的建立 一、传统的薄层色谱生物自显影方法 二、改进的薄层色谱生物自显影方法 传统的薄层色谱生物自显影方法 Rhee等采用TCL生物自显影技术对15种石蒜科植物提取物进行了AChE抑制活性测定,发现这种方法同Ellman方法相比检测限更低且避免了难溶样品给测定带来的不便。Marton等利用AChE水解乙酸-α-萘酯的产物可以和快蓝盐B发生显色反应的原理,以TCL生物自显影方法跟踪分离,显色后其背景为紫色,抑制剂斑点显白色。然而,以上TCL生物自显影方法存在三个不足: 第一、酶、底物和显色剂的用量较大,导致费用较高,难以大 规模应用,特别是对于研究经费不足的科研机构 第二、检测限过高,导致灵敏度较低 第三、显色背景和抑制剂斑点反差不明显,不易观察。 改进的薄层色谱生物自显影方法 ①酶用量的改进： 当将显色剂快蓝盐B的浓度降到0.5mg/mL时,可在酶溶液浓度为1.0U/mL的条件下出现稳定的紫色背景,但颜色很浅。 由于产生的背景很浅，不利于观察抑制斑点，因此对部分实验操作进行了改进： ⑴待测样品在薄层板上展开后,先喷酶液再喷乙酸-α-萘酯,并让它们充分反应一段时间,最后再喷快蓝盐B。这样做可以保证在实验过程中生成更多的-α-萘酚,从而可以比原方法使用更少的酶液。 ⑵实验中喷洒酶液后,并非用热风将板子完全吹干,而是改用冷风吹薄层板到没有液体流动为止,并不将板子完全吹干,这样做更有利于保持酶的活性。 ②显色背景的优化 ⑴底物溶液中所含乙醇比例对显色背景的影响：乙醇浓度不宜过高,30%-40%为宜。 ⑵底物溶液浓度对显色背景的影响：1.5mg/mL的底物浓度较为合适 ③假阳性结果的排除 将改进的TCL生物自显影方法中的乙酸-α-萘酯溶液换成α-萘酚溶液进行实验,排除由于天然产物阻止α-萘酚和快