分离工程第六章.pptVIP

二、疏水性吸附剂 各种凝胶过滤介质经偶联疏水性配基后均可用作疏水性吸附剂。 常用的疏水性配基主要有：苯基、短链烷基（C3~C8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。 因疏水性吸附作用与配基的疏水性（疏水链长度）和配基密度成正比，故配基修饰密度应根据配基的疏水性而异，一般为10~40?mol/cm3，过小则疏水性吸附作用不足，过大则洗脱困难。 * 强烈的洗脱条件，会使被洗脱的蛋白质变性。可根据系列柱实验来判断蛋白质表面的疏水性质。从而决定分辨和纯化蛋白质的方案。 * Mechanism of HIC * 疏水性配基与亲水性固定相粒子之间的偶联主要利用氨基的结合或醚键结合。 －NH－R－NH2 －NH－R －O－CH2CHCH2OR ∣ OH 其中：R＝－(CH2)nCH3，n=2~7；或R＝ R表示疏水性配基。 * 三、应用及特点 应用 HIC基于疏水性吸附分离纯化蛋白质类生物大分子，与IEC的离子交换作用完全不同，可与IEC互补短长，分离纯化利用IEC难于分离的蛋白质。 * 特点 优点 由于在高浓度盐溶液中疏水性吸附作用较大，因此HIC可直接分离盐析后的蛋白质溶液； 通过改变疏水配基链长和密度可调节吸附力，因此可根据目标产物的性质选择适宜的吸附剂； 疏水性吸附剂种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。 * 缺点 由于疏水性相互作用机理比较复杂，吸附剂的选择和洗脱分离条件不易掌握。 较高盐浓度下，疏水作用色层分离法难以得到很好的分辨率。 水中溶解度较差蛋白如球蛋白、膜结合蛋白低盐浓度也能很强地吸附，用疏水作用层析也难将它们分离。 * 思考题：简述疏水性相互作用层析用于蛋白质分离的原理和操作。 * 填空题 1、DEAE-纤维素是一种——交换剂，CM-纤维素是一种——交换剂。 2、一个带负电荷的蛋白质可牢固地结合到阴离子交换剂上，因此需要一种比原来缓冲液pH值——和离子强度——的缓冲液，才能将此蛋白质洗脱下来。 * 选择题 1、进行疏水吸附层析时，以下哪种条件比较合理（ ） （A）在有机溶剂存在时上柱，低盐溶液洗脱 （B）在有机溶剂存在时上柱，高盐溶液洗脱 （C）低盐条件下上柱，高盐溶液洗脱 （D）高盐溶液上柱，按低盐、水和有机溶剂顺序洗脱 （E）低盐条件上柱，低盐洗脱 * 回答题 用增加盐离子强度的方法，从指定的离子交换柱上洗脱下列蛋白质，指出它们被洗脱下来的先后顺序，并说明理由。已知细胞色素C的 pI=10.6，溶菌酶pI=11.0，卵清蛋白pI=4.6，肌红蛋白pI=7.0，胃蛋白酶pI=1.0，脲酶pI=5.0，血红蛋白pI=6.8。 （1）细胞色素C，溶菌酶，卵清蛋白，肌红蛋白（阴离子交换柱）； （2）细胞色素C，胃蛋白酶，脲酶，血红蛋白（阳离子交换柱） * 在一种抽提液中含有三种蛋白质，其性质如下： 蛋白质 相对分子量 等电点 A 20000 8.5 B 21000 5.9 C 5000 6.0 试设计一个方案来分离纯化这三种蛋白质。 * 同学们辛苦了！ 本章内容到此结束 * 交换容量：单位质量的干燥离子交换剂或单位体积的湿离子交换剂所能吸附的一价离子的毫摩尔数。是表征离子交换能力的主要参数。 阳离子交换剂： R-H+ + NaOH = R-Na+ + H2O 阴离子交换剂： 2R + Cl- + Na2SO4 = R2+SO42- + 2NaCl ? * 蛋白质等生物大分子与小分子化合物离子交换特性有很大差别： A、蛋白质分子量大，树脂孔道对其空间排阻作用大，不能与所有的离子交换活性中心接触。 B、离子交换吸附蛋白质分子会妨碍其他蛋白质与未吸附蛋白质离子交换基团发生作用。 * C、蛋白质是多价电荷，离子交换中可与多个离子交换基发生作用。因此蛋白质的交换容量远低于无机离子的交换容量。 * 第四节 离子交换层析 * 一、原理与操作 原理 利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱层析法。 荷电溶质在离子交换剂上的分配系数为： 其中：I为流动相的离子强度；A和B为常数； m∞为离子强度无限大时溶质的分配系数。 对于不同的溶质，A与B不同，即在离子交换剂上的分配行为不同，在洗脱过程中彼此得到分离。 * 蛋白质是多价的两性高分子电解质，具有等点pI