蛋白质定量实验研讨.pptVIP

第四实验室 主讲教师：阚慕洁 Email:Kanmj@jlu.edu.cn Tel:office)生命科学是以探求生命奥秘为中心课题。 蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能。 没有足够纯度的生物大分子，结构与功能的研究就无从谈起。 必须首先解决生物大分子的制备问题。 对获得的生物大分子进行鉴定。 离心 分子 生物学技术 电泳 层析 光学 生化 实验 生化实验内容安排 实验室 实验内容 一 实验16：DEAE纤维素离子交换层析 二 实验17：血清-γ球蛋白的提纯 实验8 ：醋酸纤维素薄膜电泳 三 实验9 ：聚丙烯酰胺凝胶电泳 四 实验3 ：测定蛋白质的比色分析法 实验12：血脂蛋白电泳 五 实验18：真核基因组DNA的分离提取 六 实验7 ：酶促反应动力学 实验19：质粒DNA的提取及酶切鉴定 第一轮 实验本身: 实验室规则: 时间、穿着、仪器不能乱动、赔偿制度、整洁、卫生。 预习报告、规范操作（辨认标签…）、如实记录、污染物、毒物、废弃物（酸碱烧伤大量自来水冲洗） 实验 实验报告要求： 题目，组号 实验目的 实验原理 实验记录：如实记录 实验结果及结果分析：实事求是 讨论或小结： 生物化学实验室规则 ① 实验前需预习实验指导和有关理论，明确实验目的、原理、预期的结果、 操作关键步骤及注意事项,写预习报告。 ② 实验要严肃认真地按照操作规程进行，注意观察实验中出现的现象和结果，并把实验数据和结果及时如实记录在实验记录本上，课后根据实验结果进行科学分析。 ③ 实验室和实验台应保持整洁。公用试剂用毕，立即盖严并还原。实验完毕，仪器洗净放好。 ④ 注意节约药品、试剂和各种物品，爱护仪器，按规程操作仪器，以免损坏。 ⑤ 实验室严禁吸烟！乙醇、丙酮等易燃物品不能直接加热，并远离火源。实验结束离开实验室之前，关好窗户，切断电源，水源，确保安全。 ⑥ 若发生酸碱灼烧事故，应用大量自来水冲洗，酸灼伤者用饱和NaHCO3溶液中和，碱灼伤者用饱和H3BO3溶液中和，氧化剂伤害者用Na2S2O4处理。 ⑦ 所有固体废弃物如：废纸、固体废弃物、沉淀物等必须弃于垃圾桶中。强酸、强碱必须倒入玻璃器皿中，用水稀释后倒入水槽。 实验三 测定蛋白质的比色分析法 实验十二 血清脂蛋白的琼脂糖凝胶电泳 血浆脂蛋白的分类 血浆脂蛋白组成特点 血浆脂蛋白的结构 血脂代谢的临床意义 理论知识 血 浆 脂 蛋 白 代 谢（Metabolism of Lipoprotein） 电泳技术简介 电泳定义 电泳技术 影响电泳速度的主要因素 电泳的分类 水平电泳装置 琼脂糖的特点 实验原理： 各种脂蛋白中所含载脂蛋白的种类及数量不同，各种脂蛋白颗粒大小、带电荷的数量相差也很大，因此以琼脂糖凝胶为支持物，在电场中可使各种脂蛋白颗粒分离开来。 实验方法（概括） 将血清脂蛋白用脂类染料（如苏丹黑或油红等）进行预染。再将预染过的血清置于琼脂糖凝胶板上进行电泳分离，通电后，可以看出脂蛋白向正极移动，并分离为几个区带。 实验操作 １、预染血清 2、制备琼脂糖凝胶板 ３、点加血清 ４、电泳 ５、观察并记录电泳结果 (1)苏丹黑染色液： 称取100nag苏丹黑B加0.2mL2氧六环混匀，加3mL无水乙醇，37 0C水浴30min。 (2)巴比妥缓冲液： 称取巴比妥钠5.4g，巴比妥2.76g及EDTA0.29g，加水溶解后再加蒸馏水至1000mL(pH为8.6．离子强度0.075)，为电极缓冲液。 (3)凝胶缓冲液： 取三羟甲基氨基甲烷1.212g，EDTA0.29g及NaCl5.85g，用蒸馏水溶解后，稀释至1000mL，pH为8.6。 (4)琼脂糖凝胶： 称取琼脂糖0.5g溶于50mL凝胶缓冲液中，再加水50ml。在水浴中加热至沸。待琼脂糖完全溶解后，立即停止加热。 试剂 实验十二 血清脂蛋白的琼脂糖凝胶电泳 实验三 测定蛋白质的比色分析法 实验目的 1. 掌握双缩脲法测定蛋白浓度的原理。 2. 掌握Lowry氏法测定蛋白浓度的原理。 3. 学会使用分光光度计。 4. 总结蛋白质定量方法的设计思路。 实验原理 一、双缩脲法测定血清总蛋白 双缩脲反应 操作 计算 试剂及器材 二、Lowry氏法测定蛋白质含量法 原理 操作 计算 试剂及器材 试剂使用规则 ① 使用试剂前应该仔细辨认标签，看清名称及浓度，是 否为本实验所需。 ② 取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试剂决不可倒回原瓶。 ③ 取标准溶液时，应该将标准溶液倒入干试管中，再用干净吸管吸取标准液，以免污染瓶中的标准液体。 ④ 使用滴管时，滴管尖端朝下，避免试剂流入橡皮帽内。 ⑤ 使用有毒试剂及