菠萝蛋白酶的提取 初级纯化及活性鉴定.ppt

菠萝蛋白酶的提取、初级纯化及活性鉴定  实验一 一、实验目的 系统地学习和掌握生命大分子物质分离纯化技术的原理及基本实验技术。 熟练掌握饱和硫酸铵沉淀法、透析法、测定蛋白质含量、蛋白酶活性检测等实验技术。 1、生命大分子物质分离纯化的一般程序： （1）选择有效成分含量丰富、稳定性好的样品材料。 （2）材料处理。 （3）确定分离纯化的方法，使粗品的纯度达到预定要求。 （4）建立灵敏、特异、精确的检测手段。 二、实验原理 2、蛋白质的分离纯化方法： (一)沉淀法 盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、聚乙二醇（PEG）沉淀法等。 在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升高，这种现象称为盐溶。 但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降，直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析。 一般进行蛋白质沉淀时，选用的盐是硫酸铵。 优点： ①溶解度大，对温度不敏感； ②分级效果好； ③有稳定蛋白质结构的作用； ④价格低廉。 缺点：盐浓度含量高。 (二)层析 主要有：离子交换层析，凝胶过滤，亲和层析 透析和超滤 透析是将待提纯的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，扎紧袋口放在缓冲液中进行的。 超滤是利用压力和离心力，借助于超滤膜将不同分子量的物质分离的技术。 3、菠萝蛋白酶活性测定 酪蛋白 酪氨酸 （275nm） 菠萝蛋白酶 三．实验试剂 1、缓冲液 （1） PBS 0.1moL/L 3000ml pH7.8 （2） PBS 0.01 mol/L 4000ml pH7.8 2、测酶活试剂 （1）1%酪蛋白（pI4.8）：200ml。 用0.1 mol/L PBS pH7.8配，50-55℃水浴溶解，不停搅拌，需1h才能溶解。 2g酪蛋白+200ml PBS（0.1 mol/L pH7.8）。 （2）激活剂 100ml（现配现用） 20 mmol/L半胱氨酸-盐酸盐，1 mmol/L EDTA-Na，用0.1 mol/L pH7.8 PBS配制至100ml。 （3）5%TCA（三氯乙酸）：200ml。 3、透析袋处理 将10 cm长的透析袋置于1000ml含1mmol/L EDTA-Na2的2%碳酸氢钠溶液中煮沸10min后，用干净镊子取出，经蒸馏水煮沸、漂洗，即可使用。 四.实验步骤 1、粗酶提取 生菠萝皮（每一组） 30g+50ml PBS 0.1 mol/L pH7.8 ↓ 电动搅拌 ↓ 2～4层纱布过滤于烧杯中 ↓ 分装于离心管（10ml/管） ↓ 平衡离心 10000r/10min ↓ 弃沉淀，取上清液，量体积倒入小烧杯 ↓ 加固体（NH4）2SO4盐析，0～30%饱和度，缓慢加入，边加边搅拌至完全溶解，倒入离心管 ↓ 4℃，1～2h ↓ 平衡离心，10000r/10min ↓ 取沉淀，再加5～8ml PBS 0.1 mol/L pH7.8溶解，如果不能完全溶解，平衡后离心10000r/5min ，弃沉淀，留上清，进行酶活测定和透析。 2、酶活测定方法（每组） 试剂 对照(调零) 实验1 实验2 实验3 TCA(ml) 酪蛋白（ml） 酶液（ml） 激活剂（ml） 3 1 0.1 0.9 — 1 0.1 0.9 — 1 0.1 0.9 — 1 0.1 0.9 37℃ 10min 水浴 TCA(ml) 3 3 3 静置 5min 滤纸过滤 A275石英比色杯 0 酶活（U） 0 酶活（U）平均值 酶活单位：在上述条件下(37℃,酶促反应10min)，每10min增加0.01个光吸收值的酶量为一个酶活力单位（U）。 3、透析去盐 把测酶活后所剩的酶蛋白吸到透析袋中,系紧,置于PBS 0.01 mol/L pH7.8的3000ml的烧杯中,置于磁力搅拌机上,进行透析；或静止透析1～2天，间中要换缓冲液3次。 五．实验结果分析 各实验组进行分析，讨论实验结果，再由老师进行归纳总结。 做好实验数据的原始记录。 交实验报告，对实验结果进行综合分析，并对该实验提出一些可行性意见。