联苯双酯对小鼠骨髓细胞辐射损伤防护作用探究.docVIP

联苯双酯对小鼠骨髓细胞辐射损伤防护作用探究 　　[摘要] 目的 探?联苯双酯对辐射致小鼠骨髓细胞损伤的防护作用。方法 体外无菌分离小鼠骨髓细胞，联苯双酯孵育30 min后给予1 Gy照射，18 h后观察对骨髓细胞的细胞活力、细胞凋亡以及活性氧水平的影响。体内实验C57小鼠分为四组，对照组、联苯双酯组、照射组和照射给药组。其中照射组和照射给药组给予4 Gy全身照射，对照组和联苯双酯组给予假照射（0Gy）。联苯双酯组和照射给药组在受照后灌胃联苯双酯（450 mg/kg），持续给药7 d，对照组和联苯双酯组给予相同体积的生理盐水。在照射第9天取骨髓细胞，计数单侧股骨骨髓细胞数量以及观察骨髓细胞的凋亡、活性氧水平以及克隆形成能力。结果 体外实验中，联苯双酯在5 μmol/L有一定的保护作用。在给予1 Gy照射后18 h，与对照组相比，照射组细胞活力显著下降、凋亡率以及活性氧水平显著升高（P 　　[Key words] Irradiation； Reactive oxygen species（ROS）； Dimethyl dicarboxylate biphenyl （DDB）； Bone marrow； Cell apoptosis 联苯双酯（dimethyl dicarboxylate biphenyl，DDB）是我国科学家在研究中药五味子中发现的一种新药，也是人工合成五味子丙素的中间产物，是临床治疗病毒性肝炎和药物性肝损伤引起转氨酶升高的常用药物[1]。前期研究Li发现联苯双酯具有清除自由基活性，而Lin则进一步研究发现联苯双酯不仅能提高肿瘤化疗敏感性，还能抑制肿瘤细胞，提高肿瘤细胞的凋亡率[2-3]。曹波等则研究发现联苯双酯还具有抗炎功能，能够抑制Cox-2酶以及IL-4，IL-8等炎症因子表达[4-8]。Li则发现联苯双酯还可引起损伤肝脏中SOD及GSH升高，从而治疗肝脏损伤[9]。而联苯双酯在辐射损伤中的作用未见报道。因此本文探讨联苯双酯对骨髓细胞辐射损伤的防护作用，并对其作用机制进行了初步的研究 1 材料与方法 1.1 小鼠与分组 C57BL/6L小鼠，雄性，体重18～22 g，10～12周龄，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号为SCXK（京）2012-0001。购买后饲养于中国医学科学院放射医学研究所SPF级动物房 1.2 照射及给药 在体外实验中骨髓细胞的照射剂量为1.0 Gy。体内实验中小鼠按体重随机分为对照组，联苯双酯组，照射组和照射给药组，每组五只，共20只小鼠。其中对照组和联苯双酯组给予假照射（0 Gy），照射组和照射给药组给予4.0 Gy全身照射。Cammacell-40137 Cs放射源为加拿大原子能公司产品，剂量率约为1.0 Gy/min。所有小鼠在照射后当日灌胃给药。照射后每天给药1次，持续给药7 d，共给药7次。其中联苯双酯组和照射给药组小鼠的联苯双酯给药剂量为450 mg/kg。对照组和照射组的小鼠给予同等体积的生理盐水。在受照后第9天，取材进行相关体内指标检测 1.3 试剂与仪器 联苯双酯由药物室周则卫老师赠送；培养基（RPMI1640）及小牛血清购自美国Gibco公司；克隆培养基（M3534）购自加拿大Stem cell公司；活性氧试剂（S0033）购自南京碧云天公司；Annexin V凋亡试剂盒购自美国Ebioscience公司；Cell Titer-BlueTM试剂购自美国Promega公司。日本Olympus倒置显微镜，日本Sysmex poch-100i全自动血液分析仪，美国Thermo CO2培养箱 1.4 细胞活力测定 脱颈处死小鼠，无菌取小鼠双侧股骨。将骨髓细胞悬液接种96孔板，加入联苯双酯。孵育30 min后，给予1.0 Gy照射，培养18 h检测细胞活力 1.5 细胞凋亡检测 将骨髓细胞按照凋亡试剂盒说明加入Annexin V和PI。室温避光孵育15 min，用流式细胞仪检测 1.6 单侧股骨有核细胞计数 无菌取小鼠胫腓骨，反复冲洗三次。用细胞计数仪计数，结果表示为×106/femur 1.7 细胞活性氧检测 骨髓细胞加入活性氧检测试剂后37℃水浴30 min，用流式细胞仪检测 1.8 集落形成能力测定 无菌收集小鼠骨髓细胞，计数。每组取16×104细胞加入到4 mL M3534培养基中，种24孔板。将24孔板置入37℃，5%CO2培养箱中培养。在培养第5天计数，克隆细胞数≥30为阳性集落，CFU-GM以每2×104个细胞形成的集落数表示 1.9 统计学处理 采用统计学软件SPSS15.0进行数据分析。正态分布计量资料以（x±s）表示。多组间比较采用方