Q10第十章聚合酶链式反应技术20161013选读.ppt

设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。 引物设计现在多用专业软件 ⑧套嵌引物（nested primers) 1 3 2 4 如Primer6.0等 dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性分解 dNTP溶液呈酸性，使用时应小量分装，-20℃冰冻保存，多次冻融会使dNTP降解 在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，浓度过低会降低PCR产物的产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性 （3） dNTP （4）模板DNA 但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。 ② 模板的量： 不能太多，100?l反应体系中100ng足够。 ① 纯度： PCR对模板DNA的纯度要求不高。 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响 在一般的 PCR反应中，dNTP浓度200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少 （5） Mg2+ PCR反应条件优化 反应温度（变性、退火、延伸） 反应时间（变性、退火、延伸） 循环次数（PCR效率及产物量） 1、温度 变性温度：94-97 ℃ 退火温度：低于引物Tm 5 ℃左右，一般55-60℃