IL1β对成纤维细胞合成Ⅰ型胶原蛋白作用及机制论文.docVIP

　　IL1β对成纤维细胞合成Ⅰ型胶原蛋白作用及机制论文 李学森 褚言琛 邹云雯 王志杰 【摘要】 目的 研究白细胞介素1β (IL1β)对成纤维细胞合成Ⅰ型胶原蛋白的作用及机制，以探讨IL1β对硬膜外瘢痕形成的影响。方法 将NIH3T3细胞随机分为IL1β组、IL1β+SB202190(p38 MAPK特异性阻断剂)组和对照组,各组经无血清培养20 h后，IL1β组加入10 μg/L的IL1β，IL1β+SB202190组用10 μmol/L的SB202190预作用1 h后加入10 μg/L的IL1β，对照组直接加体积分数0.02的血清。各组培养24 h后收集细胞，采用RTPCR法检测Ⅰ型胶原α2基因(COL1A2)mRNA的表达，ethods The NIH3T3 cells free culturing for 20 hours, 10 μg/L of IL1β ol/L) for 1 hour before adding IL1β (10 μg/L), and the control group received same volume of 2% serum. After culturing for another 24 hours, cells RNA and protein expressions of typeⅠ collagen A2 (COL1A2) detected RNA and protein expressions of COL1A2 in IL1β group RNA and protein in IL1β + SB202190 group ight inhibit the formation of epidural scar by inhibiting the expression of COL1A2 in NIH3T3 cells, and p38 signaling pathay play an important role in the process of scar formation. KEY APK信号通路是目前丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)通路中的一个重要成员,参与细胞对许多外界刺激的调节反应56。本研究应用IL1β以及p38 MAPK的特异性阻断剂(SB202190)作用NIH3T3细胞，从胶原基因的转录水平调控及蛋白水平调控来研究IL1β在纤维化过程中的作用及其机制，以期为硬膜外瘢痕的防治提供理论依据。现将结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 实验试剂 NIH3T3小鼠胚成纤维细胞(中国科学院上海细胞库)，胎牛血清(杭州四季青公司)，DMEM高糖培养基和2.5 g/L胰蛋白酶(Gibco 公司)，小鼠IL1β(PeproTech 公司),p38 MAPK特异性阻断剂SB202190(Sigma 公司)，RIPA裂解液(碧云天生物技术有限公司),以Ⅰ型胶原α2基因(COL1A2)兔多克隆抗体和βactin鼠单克隆抗体(Santa Cruz公司)为一抗,辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG(Santa Cruzs公司)为二抗, Trizol RNA提取液和RTPCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司),小鼠COL1A2 mRNA及内参照(GAPDH)的PCR引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)，化学发光剂(北京全式金生物技术有限公司),4×上样缓冲液(Solarbio公司)。 1.2 实验分组与处理 NIH3T3细胞在含体积分数0.10胎牛血清的DMEM高糖培养基中常规培养,选择对数生长期的NIH3T3细胞，用2.5 g/L的胰酶消化成单细胞悬液，按约0.5×108/L的密度以均等的细胞数分别分装到3个25 cm2培养瓶中，于37 ℃、体积分数0.05 CO2培养箱中培养，待融合达70%～80%时,随机分为IL1β组、SB202190+IL1β组及对照组，各组经无血清DMEM培养20 h后，更换培养液。IL1β组加入浓度10 μg/L的IL1β;IL1β+SB202190组用10 μmol/L的SB202190预作用1 h后更换培养液,加入浓度10 μg/L的IL1β;对照组直接加含体积分数0.02胎牛血清的培养基。经上述换液后,继续培养24 h，收集细胞。 1.3 检测指标及方法 1.3.1 COL1A2 mRNA表达的检测 应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)法。细胞培养24 h后，按照Trizol细胞裂解液说明提取细胞总RNA，所获样品总RNA的A260/A280比值为1.8～2.0。取2 μg总RNA按照逆转录试剂盒说明书方法行逆转录反应,合成cDNA,随后进行