off调控bcr-abl基因表达的细胞系 293pT2P210的建立论文.docVIP

　　off调控bcr/abl基因表达的细胞系 293pT2P210的建立论文 黄文荣 鲁茁壮 王立生 王华 段海峰 李庆芳 高春记 达万明 【摘要】 慢性髓系白血病（CML）是一种以髓系细胞受累为主的克隆性疾病。目前认为CML的主要分子发病基础为：位于9q34的abl基因与位于22q11的bcr基因相互易位形成bcr/abl融合基因，并编码具有很强蛋白酪氨酸激酶活性的P210bcr/abl融合蛋白，该蛋白通过多种信号通路抑制细胞凋亡而导致细胞转化。本研究为构建能由Tetoff诱导表达系统调控bcr/abl融合基因表达的细胞系，为深入研究bcr/abl融合基因功能及其调控机制提供一种有价值的细胞模型。将bcr/abl融合基因亚克隆到pTRE2hyg载体构建重组质粒pT2P210，同时将Tetoff质粒转染293细胞并筛选出单克隆，然后进一步转染pTRE2hygLUC质粒，通过荧光素酶活性检测选出能有效诱导目的基因表达的293Tetoff细胞，然后将重组质粒pT2P210转染到293Tetoff细胞中。结果表明：筛选出了bcr/abl融合基因能被强力霉素有效调控的293 pT2P210单克隆细胞。结论：本研究筛选的293pT2P210细胞为bcr/abl基因表达能被Tetoff诱导表达系统调控的细胞系.freelyelogenous leukemia (CML) is a clonal myeloproliferative disease of transformed hematopoietic progenitor cells. It is noeric bcr/abl P210bcr/abl fusion protein, odel that bcr/abl expression can be regulated by Tetoff inducingexpressionsystem. The fulllength b3a2 bcr/abl cDNA id. 293 cells id and the clone that the Tetoff system can id ycin B and G418 resistance. The results sho. They are suitable thoroughly to study the function of bcr/abl fusion gene and its signal regulation mechanisin. Key ; 293pT2P210 cell line; 293 cell 慢性髓系白血病（chronic myelogenous leuke mia,CML）是一种髓系克隆性疾病。CML全球年发病率约1/10万人口，占全部白血病的20%左右，自然中位生存期为3-4年。CML是目前致病分子信号基础研究最为清楚的肿瘤之一，1960年NoHⅠ,HincⅡ、引物合成及DNA测序（TaKaRa公司产品）。质粒小量制备试剂盒（Gibco公司产品）。Lipofectamine、DNA片段回收试剂盒、Marker λHindⅢ、DL2000（北京天为时代公司产品）。多西环素、Bright Luciferase Assay Kit（Promega公司产品），潮霉素（Boehringer Mannhein公司产品）。荧光检测仪（中国科学院生物物理研究所， Z2000型）。 重组质粒的构建 使用PvuⅡ酶切pTRE2hyg载体2-3小时之后进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，应用DNA回收试剂盒从凝胶中回收、纯化DNA。然后对回收的线性化pTRE2hyg载体进行5′ 端去磷酸化处理，重新回收去磷酸化的线性化载体pTRE2hyg。同时应用T4 DNA聚合酶对bcr/abl基因进行平端化处理，将补平的bcr/abl基因片段与去除5′ P的线形化载体在T4 DNA 连接酶的作用下16℃保温连接16-20小时后取5 μl进行转化反应。 转化反应 DH5α大肠杆菌感受态细胞作为转化反应细胞，按试剂盒操作说明进行，转化后12-16 小时在琼脂平板上挑取单个细菌菌落于5-7 ml LB/Amp培养基培养8-10 小时，然后进行质粒DNA的提取。 质粒DNA的提取 大肠杆菌质粒DNA的提取按试剂盒说明进行。对提取的质粒DNA取样进行酶切鉴定，对酶切鉴定正确的克隆进一步取样进行测序分析。将bcr/abl基因与pTRE2hyg载体正确连接的重组质粒称为pT2P210质粒。 Tetoff质粒转染293细胞 根据Tetoff系统说明书，按Lipofectamine试剂的操作要求在6孔培养板中将Tetoff质粒转染到293细胞， 8小时后将转