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　　RNA干扰技术沉默STAT3对人肺癌细胞生长抑制的作用论文 孙绍娟，王鸿程，许学亮，孔志斌，简丽萍，曹兵 【摘要】 目的探讨RNA干扰技术沉默STAT3基因表达对肺腺癌A549细胞的生长抑制作用。方法针对STAT3mRNA序列设计合成2对编码siRNA的DNA模板，构建pSUPERsiRNASTAT3重组质粒，转染A549细胞；采用RTPCR法检测重组质粒对STAT3基因表达的影响；在荧光显微镜下观察细胞的凋亡情况。 结果成功构建pSUPERsiRNASTAT3重组质粒.freelRNA水平，最大干扰效率达85.32％，明显高于空质粒对照组；干扰作用于转染后24h即可出现，48h达高峰，72h降低。对应不同位点的两个siRNA片段对STAT3均可产生干扰作用，彼此间差别不大。在荧光显微镜下，与未转染细胞相比，转染siRNA的A549细胞中凋亡细胞所占比例明显增加。结论pSUPERsiRNASTAT3可抑制STAT3在人肺腺癌A549细胞中的表达，并抑制肿瘤细胞的生长，促进其凋亡。以STAT3为靶点的RNA干扰技术可望成为肺癌基因治疗的新方法。 【关键词】 肺癌；RNA干扰；STAT3；凋亡 Abstract：ObjectiveTo study the effects of pSUPER siRNA STAT3 gene on the groplate coding siRNA icroscope.ResultsThe siRNA eukaryotic expression vector against STAT3 mRNA RNA in A549 cells RNA expression began to appear 24 hours after transfection．And the most apparent interfering efficiency arkedly higher than that in the cells transfected different loci had interfering effect on STAT3 mRNA expression，but there ．pared icroscope.ConclusionpSUPERsiRNASTAT3 could significantly inhibit STAT3 expression，suppress the groay provide a neethod in the gene therapy of lung cancer． Key RNA为靶点，在转录后使其沉默，不直接干扰DNA，具有特异、高效、简便快捷和小干扰RNA(siRNA)可在细胞间转移等特点47。本实验利用RNAi技术，针对STAT3基因的2个不同部位设计2对siRNA，用带有u6启动子的质粒pSUPER构建siRNASTAT3表达载体，转染人肺腺癌A549细胞，阻抑STAT3基因的过度表达，诱导肿瘤细胞凋亡，初步探讨其作为治疗肺癌新的基因靶位的可行性。 1材料与方法 1.1材料siRNA片段:从STAT3基因编码区起始密码子下游寻找符合设计特征的靶序列（9891007核苷酸碱基序列CATCTGCCTAGATCGGCTA与21442162核苷酸碱基序列GCAGCAGCTGAACAACATG），上述序列用BLAST软件进行同源分析证实为STAT3高度保守，采用化学合成法合成。主要试剂：带有u6启动子的质粒载体(pSUPER)及肺腺癌A549细胞均由四川大学华西医院提供，T4 DNA连接酶、EcoR II和HindⅢ限制性内切酶、质粒提取试剂盒及RTPCR相关试剂由上海生工提供，E.coli DH5α感受态细胞由大连宝生物公司提供，脂质体(1ipofectamine2000)、Trizol试剂由Invitrogen提供。 1.2方法 1.2.1重组质粒pSUPER–siRNA–STAT3的构建及鉴定从GenBank中STAT3 mRNA(NM003150)上寻找符合特征的靶序列，合成分别针对其编码区碱基序列的两条DNA寡核苷酸链(分别为STAT31，2，)，设计的寡核苷酸序列5’端和3’端分别含BglII和HindIII酶切位点。5’端开始为19个核苷酸的siRNA作用链序列，中间以9个核苷酸的TTCAAGAGA间隔形成发夹结构，最后为siRNA作用序列的反向重复序列；3’末端加有转录终止信号TTTTT。合成的两条互补寡核苷酸链在退火缓冲液作用下退火，形成双链结构。pSUPER经BglII和HindIII双酶切线性化，在T4 DNA连接酶的作用下与退火后形成的双链结构连接，形成pSUPERsiRNASTAT3重