POAG致病基因MYOC突变型载体的构建及在COS7细胞中的表达论文.docVIP

　　POAG致病基因MYOC突变型载体的构建及在COS7细胞中的表达论文 【摘要】 目的： 构建Pro370Leu突变型Myocilin（MYOC）基因真核表达质粒，并在COS7细胞中表达以探讨突变蛋白表达特点. 方法： 以pGEMTMYOC质粒中MYOC为模板，用PCR介导的定点突变技术，得到Pro370Leu突变型MYOC基因(mutant MYOC,mMYOC)，并定向亚克隆到真核表达质粒pDsRed2N1上，得到pDsRed2N1mMYOC重组表达质粒，再用限制性内切酶消化和DNA测序鉴定，最后用脂质体包埋转染法转染COS7细胞.freelMYOC蛋白只定位在细胞质中，经YOC蛋白只存在细胞裂解液中，经流式细胞仪检测突变型转染组凋亡细胞百分比较高为6.63%. 结论： Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒构建成功，Pro370Leu突变型MYOC基因表达的蛋白呈分泌障碍状态，并具有促进细胞凋亡的趋势. 【关键词】 MYOC基因 定点突变 凋亡 青光眼 开角型 0引言 原发性开角型青光眼(primary open angle glaua ，POAG)是主要致盲眼病之一，有研究发现POAG发病具有明显的遗传性. 1997年Stone等首次克隆了POAG的致病基因：Myocilin(MYOC)基因，该基因是迄今研究最多的与POAG相关基因，已经发现有几十种突变型与POAG致病相关，如我国发现的Pro370Leu，T455KmMYOC基因等，并对其进行了初步研究［1-2］. 本研究选择Pro370LeumMYOC基因，构建其真核表达质粒，转染COS7细胞，研究其是否有促进细胞凋亡的作用，以阐明MYOC基因突变所致的POAG发病机制. 1材料和方法 1.1材料FACSCalibur（美国BD公司）BamHI，EcoRI（美国NEB公司）；Superfect转染试剂盒（美国Invitrogen公司）；DsRed Monoclonal Antibody（mouse)，pDsRed2N1质粒（美国Clontech公司）；兔抗鼠IgGHRP（上海华美公司）； DH10b菌株和COS7细胞株（上海睿星基因公司）；pGEMTMYOC［3］（由作者构建）；上游引物AF:5′aaaagaattctg ATGAGGTTCTTCTGTGCACGTTGCTG3′；下游引物AR:5′ aaaaggatcCATCTTGGAGAGCTTGATGTCATAAGTG3′,上游突变引物MF:5′ GGCTACCACGGACAGTTCC（T突变点）GTATTCTTGGGGTG3′；下游突变引物MR:5′CACCCCAAGAATAC（A突变点）GGAACTGTCC GTGGTAGCC3′（引物由由上海生物工程公司合成）. 1. 2方法 1.2.1mMYOC基因片段克隆以pGEMTMYOC质粒中MYOC基因为模板，进行两次PCR反应完成定点突变，连接反应得到Pro370LeumMYOC基因. 第1次PCR反应引物为AF， MR；第2次PCR反应引物为MF，AR. 反应体系：10×PC R buffer 5 μL，模板pGEMTMYOC质粒100 ng，引物AF（MF）3 μL , 引物MR（AR) 3 μL，耐热Taq DNA聚合酶25 nkat，4种dNTPs（20 mmol/L）1 μL,补双蒸水至50 μL，然后94℃预变性2 min，94℃变性0.5 min，55℃退火0.5 min，72℃延伸2 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min，以水代替模板作为对照. 将两次PCR产物各取2.5 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，以紫外分光光度计定量备用. 用QIAquick 8 PCR Purification Kit纯化PCR产物，以AF，AR为引物进行连接PCR反应，经纯化得到完整的突变型基因mMYOC，用紫外分光光度计定量备用. 1.2.2pDsRed2N1mMYOC质粒构建及鉴定取适量纯化的mMYOC基因片段和pDsRed2N1质粒，分别用限制性内切酶EcoRΙ和BamHΙ双酶切. 进行连接反应将mMYOC基因片段亚克隆导入pDsRed2N1质粒，构建重组表达质粒pDsRed2N1mMYOC. 1.2.3pDsRed2N1mMYOC质粒转染COS7细胞常规培养传代，在6孔板内接种COS7细胞株，每孔约(1.5～2.5)×105个细胞，37℃，50 mL/L CO2培养过夜，至细胞60%～70%融合，采用脂质体转染法，分别采用pDsRed2N1mMYOC质粒和pDsRed2N1空质粒转染COS7细胞，每种质粒转染两个孔，以未转染的细胞为筛选对照，转