siRNA抑制ADAR1的表达对混合培养的小鼠淋巴细胞周期和凋亡的影响论文.docVIP

　　siRNA抑制ADAR1的表达对混合培养的小鼠淋巴细胞周期和凋亡的影响论文 霍斌亮蔡磊马俊张福琴赵青川 【摘要】目的：探讨RNA编辑酶ADAR1的表达受抑制后，小鼠淋巴细胞的细胞周期和细胞凋亡的变化.方法：用电转法将ADAR1特异性siRNA转入到处于混合培养的小鼠淋巴细胞中，培养48h，RTPCR检测转染效率；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡变化；RTPCR检验周期蛋白D1（cyclinD1）基因和周期蛋白A1（cyclinA1）基因表达量的变化.结果：转染ADAR1特异性siRNA48h后，小鼠淋巴细胞G0/G1期细胞量增加，S期细胞量减少，G2/M细胞量保持恒定.另外，cyclinD1基因的表达量降低而cyclinA1基因表达保持恒定.结论：处于经典混合培养体系下的小鼠淋巴细胞.freelinase1）是近来研究最为重要的一种RNA编辑酶，目前发现它与众多疾病的发生进展有关［1-3］.ADAR1是通过脱氨基的方式使RNA特异位点腺嘌呤核苷变为次黄嘌呤核苷，从而改变RNA的遗传密码，进而使其编码的蛋白质结构和功能也发生改变.RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（doublestrandedRNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象.SmallinterferingRNA(siRNA)是一种小RNA分子（21~25核苷酸），能介导识别并靶向切割同源性mRNA，高效抑制靶mRNA的表达.我们应用RNAi技术借助混合淋巴细胞培养试验模型研究ADAR1特异的siRNA对小鼠淋巴细胞周期和凋亡的影响,进一步揭示ADAR1在移植排斥中的作用. 1材料和方法 1.1材料BALB/c和C57小鼠，雄性，18～25g，各5只(第四军医大学实验动物中心)，淋巴细胞分离液(上海华精生物高科技有限公司)，DMEM培养基(美国GIBCO公司),标准胎牛血清(天津市颢阳生物制品科技责任有限公司),ADAR1特异的siRNA片段及阴性对照siRNA（广州锐博生物科技有限公司）,反转录试剂盒（Fermentas公司），2×TaqPCRMasterMix（北京天为时代科技有限公司），4308电转电融合仪（Eppendorf公司），Mastercylerep型PCR扩增仪(Eppendorf公司)，EPS2A200型电泳仪(AmershamBiosciences公司)，FR200凝胶成像系统（上海复日科技有限公司），1100pro型分光光度仪(Ultrospec公司)，318K型离心机(Sigma公司)，流式细胞仪（BD公司）. 1.2方法 1.2.1引物及引物设计ADAR1及GAPDH引物由上海鼎安生物科技有限公司合成,ADAR1基因上游引物5′CCTGTCAGCGGGTTGTTAGAGTA3′，下游引物5′TGGGAGCCATAGATTCATCAAGT3′，产物长度是610bp；GAPDH上游引物5′CATCACTGCCACCCAGAAGA3′，下游引物5′TGAAGTCGCAGGAGACAACC3′，产物长度为320bp；siRNA的正义链(5′3′)：CCAGUACUGUGUAGCAGUAdTdT，反义链(3′5′)：dTdTGGUCAUGACACAUCGUCAU；阴性siRNA产品名称NControl_05815，产品编号2005815122147.CyclinD1，cyclinA1的基因序列来源与GenBank，引物由PrimerPremier5软件设计，cyclinD1基因的上游引物5′CAGCCCTGTTACCTGATACCT3′，下游引物5′TCCCAAGCACCTCATACTACC3′，产物长度是517bp；cyclinA1基因的上游引物5′GTAACGGAGTATGCAGAGGAG3′，下游引物5′AAATGCCAGGACTTTGAGTAG3′，产物长度是390bp. 1.2.2小鼠淋巴细胞分离将BALB/c小鼠和C57小鼠分别脱颈处死，750mL/L乙醇浸泡5min，无菌取脾，Dhanks液冲洗1次，含青霉素、链霉素的双抗溶液冲洗1次，放入6cm培养皿中，加入3mLDhanks液，眼科剪将脾脏剪碎，玻璃空针针芯将碎片压碎，用400目塞网过滤，将滤得的液体以1∶1的比例小心加于小鼠淋巴细胞分离液的液平面上，2500r/min离心25min，取中间云雾状细胞层，加入适量Dhanks洗涤，1000r/min离心10min，得白色细胞沉淀，以同样的方法将所得沉淀洗涤两遍，然后将细胞重悬于含100mL/L胎牛血清的DMEM，计数.将BALB/c小鼠细胞密度调整为1.5×109/L,C57小鼠细胞密度调整为