VEGF165 表达载体的构建及其对人胃癌生长的作用论文.docVIP

　　VEGF165 表达载体的构建及其对人胃癌生长的作用论文 .freelRNA真核表达载体;用阳性脂质体介导的基因转染技术.freelm 3 明显大于未转染细胞所致的移植瘤体积（1534±363）mm3 . 结论 VEGF可以通过加强肿瘤组织血管生成而促进肿瘤的生长，另外，VEGF的表达可能与细胞增殖能力有关. Keyach neoplasms;vascular endothelial groore directly establish the role of VEGF in the oncogenesis of human gastric carcinoma.METHODS VEGF165 sense RNA expression vector ice of transfected cells ined.RESULTS Introduction of the VEGF sense construct into SGC-7901cells resulted in a marked increase in the expression of VEGF-specific mRNA and protein by dot blot and im-munofluorescence staining analysis in transfected tumor cells.Cell cycle analysis shober of transfected cells had an increase（0.44）in G2 phase and a decrease（0.17）in S phase，and its colony forming rate（9.0%）e of tumor（2351±638）mm3 in the nude mice inoculated m3 in nude mice inoculated ight pro-mote the groor;in addition，it might corre-late or cell. 0 引言 目前的研究已经表明，血管生成是恶性肿瘤迅速增殖并转移扩散的主要条件之一［1］ .随着人们对血管生成诱导剂的深入研究，已发现有许多生长因子，如转化生长因子刺激新生血管形成的作用是通过全部或部分诱导血管内皮生长因子（VEGF）表达而实现的.VEGF是一类特异性血管内皮刺激因子，它高效特异地作用于血管内皮细胞，对其有强烈的促分裂作用和趋化作用［2-4］ :①增强微血管通透性，促进血浆纤维蛋白外渗，为血管形成过程中多种细胞迁移提供一个纤维网络;②通过与内皮细胞上两个特殊受体flt和flk（KDR）作用，直接刺激内皮细胞增殖，并产生纤维蛋白溶酶原激活剂和胶原酶，这不仅可促进内皮细胞移动，有利于血管生成，而且还有利于癌细胞脱落进入血管或向邻近纤维蛋白和结缔组织基质扩散，此方式为肿瘤的浸润、转移创造条件［5，6］ .另有实验表明，胃癌组织高水平表达VEGF，其表达量与肿瘤的恶性程度呈正相关［7］ .我们通过基因转染技术使胃癌细胞过表达VEGF，更直接地研究VEGF对肿瘤生长的影响. 1 材料和方法 1.1 材料 限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、无DNA酶的Rnase购自Promega公司，Lipofect Amine由Gibco公司提供，G418由Sigma公司提供，RNA地高辛标记试剂盒（SP6/T7）购自Boehringer Mannheim公司，FITC标记的羊抗兔IgG由Vector公司提供.人胃癌细胞系SGC-7901、宿主菌E.coli DH5α和JM109均为本校西京医院全军消化性疾病研究所保存.含有605bp的人VEGF165 cDNA基因被克隆在pGEM-3Zf（+）的BamHI位点质粒pGEM-hVEGF由美国加利福尼亚大学医学院癌症研究所Abraham教授惠赠;pcDNA3 真核表达载体由本校生物化学教研室柴玉波博士惠赠.BALB/c裸小鼠由本校实验动物中心提供并饲养. 1.2 方法 1.2.1 VEGF165 真核表达载体的构建、鉴定、扩增及纯化 采用小量酶切反应法，应用BamHI，EcoRI+HindIII，EcoRI，PstI分别对pGEM-hVEGF进行初步酶切鉴定，并对其进行T7测序.根据pGEM-3Zf（+）及pcDNA3 图谱确定克隆策略.用EcoRI+XbaI消化pGEM-hVEGF后得到VEGF的cDNA可正向克隆于由此两种酶消化后的pcDNA3 中.连接产物转化大肠杆菌进行扩增.挑单一菌落，以碱裂解法小量提取质粒，对其进行酶切鉴定，然后对阳性重组子进行大量质粒提取，并纯化再进行酶切鉴