Velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡研究论文.docVIP

　　Velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡研究论文 .freelol/L velcade处理U266细胞活率，用流式细胞术分析Annexin-V、线粒体跨膜电位(Δψm)和氧自由基（ROS），用半定量RT-PCR法检测bcl-2 mRNA的表达。结果表明：velcade抑制U266细胞增殖；诱导U266细胞凋亡.freela Cell Line U266 Apoptosis Induced by Velcade Abstract To investigate the effect of velcade on multiple myeloma cell line U266 apoptosis and its mechanism，cell viability ated by trypan blue dye exclusion. Annexin-V，mitochondrial transmembrane potential (Δψm) and reactive oxygen species (ROS) labeled by DCFHDA ined by floetry，the expression of bcl-2 mRNA i-quatitative RT-PCR. The results shoorphologic characteristics of apoptosis. Velcade at 50 nmol/L increased Annexin V positivity and fluorescence intensity of DCF because of ROS generation of U266 cells. Expression of anti-apoptotic gene bcl-2 mRNA also decreased. It is concluded that velcade inhibite the groultiple myeloma; apoptosis 多发性骨髓瘤（MM）是一种浆细胞克隆性增生的血液系统恶性肿瘤，多发生于老年人。随着社会人口的老龄化，其发病率呈逐渐增高的趋势。几十年来对MM一直采用激素和细胞毒性药物联合治疗，尽管近年来加用反应停抑制血管新生治疗或采用自体骨髓移植治疗，但其仍是一种不可治愈的血液系统肿瘤。由此可见，开发新的治疗方法有重要的临床价值。蛋白酶体抑制剂近年来作为MM新的治疗制剂用于临床试验，本研究就临床新药蛋白酶体抑制剂velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞的凋亡作用进行探讨。 材料和方法 细胞培养 U266细胞置于含10%的热灭活胎牛血清的RPMI 1640培养液（Gibco公司产品） 中，于37℃、5% CO2和95%空气湿度条件下进行培养。实验过程中，细胞以（2-5）×105 细胞/毫升的密度接种培养，并与不同浓度velcade一起进行孵育，对照加DMSO。细胞活率由台盼蓝拒染法检测，根据处理组存活细胞数与死细胞数的比例来计算。形态学观察，细胞用cytospin (Shandon，Runcorn，UK)收集至载玻片，用瑞氏染液染色并置于光学显微镜下观察。每次试验重复3次。生长抑制率及细胞活率按如下公式计算： 生长抑制率 ＝［(对照组细胞数-处理组细胞数)／对照组细胞数］×100% 存活率＝［活细胞数／(活细胞数＋死细胞数)］×100% Annexin-V、线粒体跨膜电位(Δψm)和氧自由基（ROS）的流式细胞仪分析 Annexin-V 分析 使用FITC标记的Annexin V和PI双染法检测细胞凋亡，根据 Becton Dickinson Biosciences 公司提供的说明书进行操作。简单地说，取（1-2）×105 细胞，经PBS 漂洗后加100 μl 结合缓冲液，重悬细胞，加5 μl AnnexinV-FITC，10μl PI 避光孵育15 分钟后加400 μl 结合缓冲液，用流式细胞仪检测。 线粒体跨膜电位(Δψm)检测 取5×105细胞，用PBS清洗1次，加入10 μg/ml Rh123（Sigma公司产品）37℃孵育30分钟，用PBS漂洗1次，加入终浓度10 μg/ml PI 4℃暗处放置30分钟，用流式细胞仪检测。 活性氧测定 细胞内活性氧测定方法参照文献［1］方法进行，DCFHDA (Sigma公司产品)自由扩散进入细胞后被酯酶催化变成DCFH，在活性氧存在下被氧化成DCF，DCF 荧光强度与细胞内活性氧水平呈正比。DCF 的激发波长为485 nm，吸收波长为530 nm。将药物处理的细胞（1×105）经过PBS洗涤，重悬于1 ml含有10 μmol/L DCFHDA的PBS中，以未加染料的样品作