α 在血管内皮细胞凋亡中的作用论文.docVIP

　　α 在血管内皮细胞凋亡中的作用论文 .freelL-1 EC凋亡率分别为（2.6±0.42）%～（13.7±2.6）%;TNFα 抗体明显拮抗TNFα 诱导的EC凋亡（P 0.01）. 结论 TNFα 可引起EC的凋亡和死亡，具有时间依赖性和浓度依赖性，人重组TNFα 单抗可消除因TNFα 引起的毒性作用. Keyor necrosis factor;apoptosis;skin/injuries;endothelium，vascular Abstract:AIM To study the effect of TNFα on apoptosis of vascular endothelial cells（VEC）in early second thrombosis after skin avulsion.METHODS It ental group（EC+TNFα ）and inhibitory group（rhTNFα Ab pretreatment of EC+TNFα ）.According to various times and concentration，apoptosis rate of vascular endothelial cells easured by FCM for experimental group and inhibitory group.RESULTS TNFα caused massive death of endothelial cells in primary culture in a concentration-and time-dependent manner.Apoptosis rate of EC 0to48h and（2.6±0.42）%～（13.7±2.6）%from0to3000u mL-1 in experimental group，and it de-creased significantly in inhibitory group.CONCLUSION TNFα causes apoptosis of EC in a concentration-and time-de-pendent manner and rhTNF α monoclonal antibody can de-crease cytotoxic for EC caused by TNFα . 0 引言 血管内皮细胞（vascular endothelial cells，VEC）是机体调节心血管系统的内分泌器官.在创伤、动脉粥样硬化等疾病中，氧自由基、炎性介质、Ca2+ 超负荷等因素可引起损伤EC，内皮细胞（endothelial cells，出现EC）功能障碍［1-3］ .EC损伤除以“坏死”形式出现外，还可发生“凋亡”，即一种细胞自主的有序性死亡.在皮肤撕脱伤撕脱皮瓣中，血液和组织TNFα 明显升高［2］ ，VEC的坏死除直接皮肤挤压撕脱因素外，是否存在着TNFα 的升高引起VEC的凋亡不得而知.我们通过探讨TNFα 在VEC凋亡中的作用，了解皮肤撕脱伤早期血栓形成所致的组织坏死机制. 1 材料和方法 1.1 材料 Ⅰ型胶原酶系Sigma产品，DMEM系Hyclone产品，TNFα 和TNFα 系Promega产品;内皮细胞系获自娩出30min人胎盘脐静脉. 1.2 方法 HUVEC培养用0.5g L-1 胶原酶从脐静脉中消化、分离EC，含200ml L-1 胎牛血清的DMEM培养，将培养的EC第2或3代以2×10 4 个细胞/cm2 接种到25mL培养瓶，直至融合［2］ .分为2组，①实验组:EC+TNFα （n=3），②拮抗组:预处理的EC+TNFα +TNFα 抗体（n=3）.分别测定TNF α 浓度为3000u mL-1 条件下37℃，50mL L-1 CO2 培养箱孵育，时间为0，8，24及48h实验组EC的凋亡率;TNFα 浓度分别为0，50，200及3000ku L-1 条件下孵育时间为8h实验组EC的凋亡率;以及拮抗组8h，3000ku L-1 条件下EC凋亡率.人重组TNFα 抗体被稀释1/100（15mg L-1 ），预处理的方法:EC与TNFα 抗体在TNFα 加入前37℃孵育1h. 用细胞刮子将培养的EC从培养瓶中刮出（避免用胰酶消化损伤细胞膜），在室温条件下离心（500r min-1 ，5min），弃上清液.向各离心管内加入结合缓冲液490μL，混匀，将EC数量配制成5×105 ～1×10 6 个.先加入碘化丙啶（PI）10μL，后加入结合素V（Annexin V）5μL进行活细胞荧光双标记（Gibco公司产品