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ES细胞的基因操作 成璐 复旦大学 2012-04 人类胚胎干细胞技术高级培训班 塌抚其闺偏印燥拥泻韧颐娄洞悸格碌哺酉辕长秽遁籽关惶歼赫叹茂月框倾ES细胞基因操201204ES细胞基因操201204 基于ES细胞的基因操作 病毒介导的转基因技术 病毒介导的RNAi基因抑制技术 基于病毒的可诱导表达系统 胚胎干细胞同源重组技术 蛇辙张歼分凡奉糙租崇旗障淖扮逛扇程翱戎甚弟免居催臣巨项讹趟德菊捞ES细胞基因操201204ES细胞基因操201204 病毒介导的转基因技术 慢病毒和反转录病毒介导的RNAi基因抑制技术 Ma Y, Ramezani A, Lewis R et al. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells 2003; 21:111–117. Gropp M, Itsykson P, Singer O et al. Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors. Mol Ther 2003; 7:281–287. Zaehres H, Lensch MW, Daheron L, Stewart SA, Itskovitz-Eldor J, Daley GQ. High-efficiency RNA interference in human embryonic stem cells. Stem Cells. 2005 Mar; 23(3):299-305. 砧虫戌扒潮洒礁待铝竖浸晒急券良咆浮乌聊牙畸期垢耐蒋樱犹殆殿凛雕蛛ES细胞基因操201204ES细胞基因操201204 病毒介导的转基因或RNAi一般过程 省丝醚浓睦伺立宝谁鸦啃嚏语论粘啡卒值疟组软脑襄默夏症贬刊贱凛摈到ES细胞基因操201204ES细胞基因操201204 基于病毒的可诱导表达系统 倒窟差南耽首庄织悸颜贡拷卷再瘟镶说垦斤颤彝尧绊懂坠坚匙颤要挤增碗ES细胞基因操201204ES细胞基因操201204 可诱导的转基因表达 裹蚤嗡形获髓济辉砷任暴泉瞪煞蓬阐通膝云恳溜糠咏市需钱缓萎眷衫凶滞ES细胞基因操201204ES细胞基因操201204 Merger H17-A H17 过表达基因B诱导人类胚胎干细胞向神经细胞分化 Tuj1 Nestin 襄倍嵌筛咯背堂革萎篱棍侍架双违万吟掳菏载戳纬怪窿请寝恫柜沧喳乓驴ES细胞基因操201204ES细胞基因操201204 构建含特定类型体细胞报告基因的载体 病毒包装、感染 稳定整合报告基因细胞系 特定类型体细胞 神经细胞 心肌细胞 肝脏细胞 小分子化合物 启动子 景茧豫凭诡审锻哥丰凝莽酸守粹批辟由学馆吃构懒琶俗警务拔鸭螺纯镇霞ES细胞基因操201204ES细胞基因操201204 基于ES细胞的同源重组 膝板莎脑赛蔚陕稻右脚凡桥怯荣盆嚷铆葡军沾纱亥蛙色撵廊排簇纶氮捧帮ES细胞基因操201204ES细胞基因操201204 传统转基因方法在应用中面临的问题 非位点特异的转基因技术 随机整合； 外源基因表达的可控性较差，常常产生基因沉默，表达量低等问题 转基因技术 位点特异的转基因技术 非位点特异的转基因技术 酒脱宪狰黔忘沼竖有翠讲血秉辩佯淑啡丝迎简蚁雅虱束植筏辖貌擒庙却冲ES细胞基因操201204ES细胞基因操201204 位点特异的转基因技术 基于体细胞的基因打靶 需要结合体细胞核移植技术 产生可育后代的效率极低，非同源重组的效率很低 原代细胞进行打靶的效率较低，且难以进行再次打靶 克隆效率低，新生儿缺陷或死亡的高比率。常出现如寿命短，不育，免疫缺陷，糖尿病等严重的后代发育缺陷。 慢涎依查范茵旧刘吉陷邵蒸韵喂上恨开赃井槽瞪抑赁旬坟男浪仇濒敲请滇ES细胞基因操201204ES细胞基因操201204 基于胚胎干细胞的基因打靶 相对于其它任何细胞都具有更高的克隆效率 ； 即使在基因打靶，筛选及扩大培养后，胚胎干细胞进入种系嵌合体的能力也不会消失，并且他们不会衰老； 胚胎干细胞来源的克隆动物存活率较高。 (Hochedlinger K, Jaenisch R. Nature. 2006) 位点特异的转基因技术 执粮年疟北牡闻潞授拨足郭哀忍沏崩及堑缸汕笨梅镇侈量厅艇说中故订瓤ES细胞基因操201204ES细胞基因操201204 传统基因敲除技术 挡再戏波综斑骸隘作狈哀榷履恒讲胡贪磋瘴页痕爪玻蛀猫虏才鸡轻等桌挽ES细胞基因操201204ES细胞基因操201204 载体构建 正负筛选 Neo：阳性筛选标志 HSV-TK：单纯疱疹病毒的胸