丙肝病毒核心基因克隆载体pGEMHCV-core的构建论文.docVIP

　　丙肝病毒核心基因克隆载体pGEMHCV/core的构建论文 【摘要】 目的 构建丙肝病毒核心基因克隆载体pGEM-HCV/core，为进一步研究外部引导序列（external guide sequence, EGS）引导核糖核酸酶P在RNA水平阻断丙肝病毒核心基因的表达做好前期基础。方法 将含HCV全长基因的pBRTM／HCV1301l质粒于大肠杆菌JMl09内扩增；提取pBRTM／HCV1301l质粒；从pBRTM／HCV1301l质粒中PCR扩增出HCV核心基因片段并将其插入pGEM3Z克隆载体；以得到重组的pGEM-HCV/core克隆载体；最后EcoR I and Hind III双酶切鉴定HCV核心基因克隆载体。结果 pGEM-HCV/core克隆载体经双酶切、凝胶电泳证明插入片段与HCV 核心基因片段大小相符；经测序证明其插入序列与HCV core基因序列一致。结论 成功构建了HCV 核心基因的克隆载体pGEM-HCV/core。 【关键词】 HCV；core基因；载体；EGS Abstract:Objective To construct the clone plasmid containing the core gene of HCV, preparing for the research of blockage of the expression of HCV core gene guided by EGS at the level of mRNA.Methods After expanding plasmid pBRTM /HCV13011 (containing the e of HCV) through E. coli JM109. The core gene plified plate; The core segment id pGEM3Z. Plasmid pGEM-HCV/core id pGEMHCV/core has successfully been constructed. Key e of guide sequence,M1GS)在RNA水平阻断HCV 核心基因的表达，为开展包括抗HCV疫苗和药物研发等临床应用提供重要的物质基础。 1 材料与方法 1.1 材料 大肠杆菌菌株JM109，购自鼎国生物公司。用CaCl2法制备感受态菌，-80 ℃保存。质粒pBRTM ／HCV13011.freelol/L的CaCl2溶液制备JM109感受态菌；将质粒pBRTM／HCV13011及pGEM3Z克隆载体分别转化JM109感受态菌，筛选阳性菌落，小量制备质粒DNA，经酶切及琼脂糖凝胶电泳分析选出含相应质粒的阳性细菌克隆,见图1。 将转化有pBRTM／HCV13011及pGEM3Z克隆载体的细菌分别接种于含四环素和含氨苄青霉素的平板中，倒置于生化培养箱37 ℃恒温培养16 h。挑单个菌落分别接种于含四环素和含氨苄青霉素的LB液体培养基中，剧烈振荡过夜，用盖宁微量质粒提取试剂盒提取pBRTM／HCV13011及pGEM3Z。 M：MarkerⅢ; 1：pBRTM／HCV13011 图1 pBRTM／HCV13011质粒（略） Fig.1 pBRTM／HCV13011 plasmid 1.4.2 HCV核心基因的PCR扩增 用PCR方法以pBRTM／HCV1301l质粒为模板扩增HCV 核心基因序列，在上游引入EcoRI酶切位点，并在下游引入BamHI酶切位点，并在两端各加入3个保护碱基。PCR的反应程序如下：94 ℃变性5 min，94 ℃45 s，55 ℃45 s，72 ℃聚合延伸反应5 min，共循环30次。PCR产物经DNA片段纯化试剂盒清洁。 1.4.3 克隆载体的构建 先用EcoRI、HindIII分别酶切HCV 核心基因片段（PCR回收产物）和pGEM3Z克隆载体，经37 ℃酶切过夜后用DNA片段纯化试剂盒清洁酶切产物。然后将经双酶切的pGEM3Z克隆载体与HCV core片段16℃连接过夜。最后将连接产物转化JM109感受态大肠杆菌，于37 ℃恒温培养16～20 h，观察结果。 1.4.4 克隆载体的鉴定 经氨苄青霉素培养基筛选，挑取克隆行EcoRI、HindIII双酶切以及琼脂糖电泳筛选出含有HCV核心蛋白基因片段大小的阳性克隆。阳性克隆者送英俊生物公司测序。 2 结果 2.1 质粒的扩增及纯化 质粒pBRTM／HCV13011是由HCV全长基因（9.6 kb）和pBR322载体(4 361 bp)重组形成的质粒，大小约为13 961 bp,如图1所示。pGEM3Z克隆载体大小为2