中药材 DNA 分子标记研究的技术问题 Ⅰ.植物药基因组 DNA 的提取论文.docVIP

　　中药材 DNA 分子标记研究的技术问题 Ⅰ.植物药基因组 DNA 的提取论文 摘 要: 随着 DNA 分子标记技术在中药中的广泛应用，快速有效地将 材料中的 DNA 提取出来 成为研究的关键步骤。综述了 90 年代以来文献报道的针对提取过程中出现的各种问题所 采取的相应措施，主要涉及如何去除提取材料中的酚类和多糖类杂质。 DNA 分子标记应用于中药资源、鉴定、栽培等方面有着很好的发展前景，目前研究报道正日 益增多。一般来说，该技术涉及的分子生物学原理比较简单，实验方法也不复杂，但熟练掌 握，灵活运用.freelmonium bromide)是一种去污剂，它可 与核酸形成复合物，这些复合物在高盐溶液(＞0.7 mol/L NaCl)中可溶并且稳定存在，但如 果 降低盐的浓度(＜0.5 mol/L NaCl)，CTAB 与核酸的复合物就会因溶解度降低而沉淀出来， 大部分的蛋白及多糖仍溶于溶液中。 该方法是植物 DNA 提取的经典方法［7～11］，抽提缓冲液加入一定量的 β-巯基 乙醇，可起到防止酚类氧化的作用，如果材料中酚类成分较多，可将其含量提高至6%［ 12］。技术关键是提取过程加入 10% CTAB 提取液和 1% CTAB 沉淀缓冲液的量一定要准 确，否则 CTAB-DNA 复合物沉淀不易产生或得到的 DNA 会有部分降解［13，14］。 当材料中多糖少时，可不用 1% CTAB 沉淀缓冲液来沉淀 DNA，在经氯仿-异戊醇(24∶1)抽 提之后，用异丙醇或乙醇沉淀 DNA，使提取过程简化［15，16］。 2.2 SDS 法［7］：SDS(Sodium dodecyl sulfate)是阳离子去污剂。用含有高浓度 SDS 的抽提缓冲液在 55 ℃ 对植物细胞进行裂解后，用提高盐浓度(KAc 或 NH4Ac)和降 低温度(冰上保温)的办法沉淀除去蛋白和多糖，剩下的 DNA 再进一步纯化，该法提取出的 DNA 常含有较多的多糖，但如果材料本身多糖含量不高或其含量未超过一定限度而对进一步 研究无影响时仍可使用。已有较多使用 SDS 法提取 DNA 成功的报道［17～19］。 3 DNA 提取过程中杂质的去除 对于幼嫩的材料(鲜品或硅胶快速干燥品)，一般方法都可得到很好的 DNA，但对于中药，研 究材料常常无法选择。各种各样的来源、药用部位、采收季节、加工方法及贮藏条件都将会 碰到，虽然中药的 DNA 提取方法已有一些报道［13，17］，但目前尚没有通用的方 法。针对某一具体材料，常规的方法可能都不奏效，如何去除上述的两类主要杂质，下列处 理办法可供参考。 3.1 去除多糖：如果材料中含有较多多糖，一般提取方法将很难去除。多糖常与 DNA 共 沉淀 而使沉淀物呈胶冻状。少量的多糖一般不影响 DNA 的限制性酶解或扩增，但当下一步研究 无法进行时，则要考虑在提取 DNA 过程中去除多糖。 3.1.1 在 DNA 未溶出之前，先用一些缓冲液洗去多糖。如可用缓冲液：100 mmol/LTris -HCl(pH=8.0)、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L Sorbitol洗几次［3，20］。 3.1.2 使 DNA 提取液中的多糖先沉淀。在提取液中加入 0.35 倍体积的无水乙醇，迅 速混匀，多糖会先沉淀［22］。 3.1.3 沉淀 DNA 时，使多糖保留在溶液中。 1)高盐法：如用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入 1/2 体积的 5 mol/L NaCl［23］ ，或加 NH4Ac 使终浓度为 10 mmol/L［24］。 2)PEG(聚乙二醇，MNO(4-methylmorpholin-N-oxide)处理，渗透破 裂，快速冷冻，微 波降解，酸碱处理并加纤维素、半纤维素酶消化，以及微珠机械粉碎等方法，试验了 8 种 裸子植物和被子植物花粉，以用最后一种方法最好，提取介质为十二烷基磺酸锂(lithium dodecyl sulfate)优于 SDS 和 CTAB［31］。 4.2 种子：种子中常贮藏较多的蛋白和淀粉，一般不影响 DNA 的有效提取，CTAB 法和 S DS 法均可，得到的 DNA 一般有些降解，与种子的贮存时间呈正相关，但情况好于腊叶标本 材料［14，32］。 4.3 浸制标本：有时会需要从浸制标本中提取 DNA。不论浸液是卡诺固定液、FAA 或 不同 浓度的醇均对材料中的蛋白起作用，使得 染色体中与 DNA 结合的蛋白质不易解离，提 取介质中一定要加入蛋白酶，Proteinase E 或 Proteinase K 均可［33］。 5 DNA 质量的检测 提取得到 DNA 要进行数量和质量的检测。 5.1 外观：好的 DNA 沉淀为白色