丹曲林钠对类缺血小鼠皮质神经元的［Ca2+］i和细胞活力的影响论文.docVIP

　　丹曲林钠对类缺血小鼠皮质神经元的［Ca2+］i和细胞活力的影响论文 高军宪，万琪，田晔，李力，刘勇红 【关键词】 ,钙离子 【Abstract】 AIM: To study the changes of intracellular ［Ca2+］ and cell activity in cortical neurons folloiclike conditioning and to explore the protective effects of dantrolene on the neurons. METHODS: Neurons easured by fluorescent intensity (FI) in each cell icroscopy and the degree of injured neurons in ischemiclike conditioning, a rapid increase in fluorescence intensity ic group and therapy group (P 0.05). The A value of injured neurons in ischemic group iclike conditioning. 【Key; ischemiclike; dantrolene 【摘要】 目的： 观察类缺血后神经元内钙离子浓度及细胞活性的变化,探讨缺血性神经元的损伤与细胞内钙离子的关系及丹曲林钠（Dantrolene）的作用. 方法： 采用孕小鼠皮层神经元培养技术，应用相差显微镜观察培养的神经元形态，激光共聚焦扫描显微镜检测细胞内钙离子浓度. 结果： 给予神经元类缺血处理5 min后,神经元内钙离子浓度与丹曲林钠组无显著差异(P 0.05). 类缺血处理10 min后再灌注15 min细胞损伤程度较丹曲林钠干预组［Ca2+］i和MTT有显著性差异(P 0.01). 结论： 丹曲林钠可抑制神经元细胞内钙离子浓度的升高,降低缺血性神经元损伤的程度. 【关键词】 钙离子；类缺血；丹曲林钠 0引言 神经元对缺血、缺氧十分敏感，即使时间很短也会造成不可逆损伤.freelm塑料培养皿中央钻一直径10 mm的圆孔，将18 mm×18 mm盖玻片用加拿大胶粘于孔底部，消毒后使用. 1.2.2配制人工脑脊液其组成为（mmol L-1）：NaCl 123, KCl 3.75, KH2PO4 1.25, NaHCO3 26, MgCl2 1, CaCl2 2, 葡萄糖10，pH=7.4. 1.2.3细胞培养取孕15 d昆明种二级孕鼠，引臼脱颈处死,.freelin),静置2~3 min 弃上清,200 g L-1胎牛血清的DMEM终止消化5~8 min,以完全培养基(100 mL L-1胎牛血清,青、链霉素1×1011 U L-1)稀释至7×108 L-1密度并接种于经多聚赖氨酸(Sigma )处理过的专用培养皿和96孔板(细胞接种1×105/孔),送入含50 mL L-1 CO2和950 mL L-1 O2的培养箱(Sanyo公司), 37℃,培养48 h后,加入阿糖胞苷(5 mg L-1)以抑制非神经元的继续生长,每隔2 d半量换液,培养10 d后,可见典型的神经元细胞，经βtubulin免疫荧光染色显示80%以上细胞为阳性，可认为是纯神经元培养［3］. 1.2.4类缺血模型建立细胞培养基换为不含糖的人工脑脊液ngACSF，温度保持在(30±2)℃，混合气体换为920 mL L-1 N2/80 mL L-1 CO2. 1.2.5实验分组缺血组(对照组)：按类缺血模型处理5和10 min. 实验组：给予30 μmol L-1丹曲林钠（Sigma公司）孵育10~15 min后，类缺血处理5和10 min. 同时对照组及实验组均分为有钙ngACSF和无钙ngACSF 2组. 每组取n=8个细胞测其△FI作为观察结果. 1.2.6神经元细胞［Ca2+］i的浓度测定将培养皿内培养的细胞经磷酸缓冲液（PBS）冲洗3次，于37℃条件下用Fluo3/Am(终浓度10 μmol L-1, BioRad公司)负载30 min, PBS冲洗3次，将培养皿置于ACAS570载物台上，在激光共聚焦显微镜下动态扫描细胞内荧光强度变化（Fig 1），激发波长488 nm, 发射波长522 nm，采样频率为488 Hz,共聚焦系统由BioRad公司MRC1024提供的TimeCourse/Ratiometric软件控制，每皿选2~3个视野，以平均荧光强度变化（FI）反映胞内游离钙离子浓度的相对水平［4］. 1.2.7MTT测定向96孔板每孔加入