丹玄口康对槟榔提取液刺激下的人口腔黏膜成纤维细胞增殖及增殖细胞核抗原表达的影响论文.docVIP

　　丹玄口康对槟榔提取液刺激下的人口腔黏膜成纤维细胞增殖及增殖细胞核抗原表达的影响论文 .freelL ANE为诱导剂,10%大鼠丹玄口康药物血清为干预物；用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)法测定细胞增殖速度,用免疫细胞化学法检测PA的表达。结果 MTT显示,丹玄口康组的OD值低于ANE刺激组(P 0.01或P 0.05),丹玄口康组免疫阳性细胞数及相对灰度值均低于ANE刺激组(P 0.01或P 0.05)。结论 丹玄口康能够抑制ANE刺激下的人口腔黏膜FB的增殖,下调PA的表达。 【关键词】 丹玄口康 槟榔提取液 成纤维细胞 增殖细胞核抗原 Abstract：Objective To study the effect of Danxuan Koukang (DXKK) drug serum on proliferation and proliferating cell nuclear antigen (PA) production of human oral mucosal fibroblasts (FB) induced by areca nut extract (ANE). Methods Human oral mucosal FB L ANE ent and 10% DXKK drug serum as intervenor. The cell proliferation rates easured by MTT assay, PA productions ined by immunocytechemistry. Results MTT assay shomunocytechemistry shoan oral mucosal FB induced by ANE. Key ucous Fibrosis,OSF)是一种以胶原纤维堆积为主要病变特征的慢性隐匿性疾病,.freela),二甲基亚砜(DMSO,Sigma产品),PA免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；槟榔提取液(ANE),按文献方法3制备；丹玄口康片,湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供,批显微镜(Motic),图像分析系统(Motic Images Advanced 3.2)。 1.2 丹玄口康药物血清的制备 成年健康SD大鼠30只,随机分为3组：正常组、丹玄口康低剂量组和丹玄口康高剂量组,每组10只,分别以生理盐水、丹玄口康4、12 g/kg(按照体表面积药物剂量换算公式计算,分别相当70 kg成人剂量的1、3倍)灌胃,2次/d,连续5 d。大鼠末次灌胃1 h后,无菌条件下颈动脉采血,室温静置2 h, 1 500 r/min离心10 min制备血清,56 ℃灭活30 min,0.22 μm滤器除菌后,用DMEM配制成含10%大鼠血清的培养液备用。 1.3 成纤维细胞的培养与槟榔提取液诱导成纤维细胞增殖的浓度 人口腔黏膜FB的培养与鉴定按我们前期实验1介绍的方法进行,并根据前期实验结果确定诱导FB增殖的ANE浓度为100 μg/mL。用第3～4代细胞进行试验。 1.4 细胞分组 第1组为正常对照组：10%正常大鼠血清；第2组为ANE刺激组：10%正常大鼠血清＋100 μg/mL ANE；第3组为丹玄口康低剂量组：10%低剂量丹玄口康含药血清＋100 μg/mL ANE；第4组为丹玄口康高剂量组：10%高剂量丹玄口康含药血清＋100 μg/mL ANE。 1.5 MTT法检测成纤维细胞增殖活性 细胞以5×104个/mL的密度接种于96孔板中,每组设复孔6个,培养48 h后弃培养液,用无血清DMEM培养液洗后,每孔加入含5 mg/mL MTT的200 μL无血清DMEM培养液,37 ℃继续培养4 h。吸净孔内上清液,每孔加入150 μL DMSO,振荡10 min,选择490 nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(OD),记录结果并重复2次。每组另设1孔只含培养液不含细胞的空白调零孔。 1.6 免疫细胞化学方法检测增殖细胞核抗原的表达 细胞以5×104个/mL的密度接种于贴有盖玻片(经鼠尾胶处理)的24孔板中,培养48 h后,4%多聚甲醛室温固定15 min后进行免疫细胞化学染色,方法按试剂盒说明书进行。脱水、透明、封片。每片取5个视野,在低倍镜下对免疫阳性细胞进行计数并求平均值,在高倍镜下摄取图像传至计算机,采用图像分析系统,测定免疫阳性细胞的灰度值,同时测量背低灰度值,计算其差值的绝对值,即得出免疫阳性细胞的相对灰度值。系统数字化图像的精度为256级,最黑的为0,最白的为255,故反应产物显色越深,灰度值越小,反之灰度值越大。 1.7 统计学方法 实验数据用x±s表示,多