丹红注射液对大鼠皮质神经元体外模拟缺血再灌注损伤的保护作用论文.docVIP

　　丹红注射液对大鼠皮质神经元体外模拟缺血再灌注损伤的保护作用论文 张红 张睿 张小乔 徐江华 李琴 梅元武 【摘要】 目的 探讨体外模拟缺血再灌注后大鼠皮质神经元内质网应激诱导凋亡的机制及丹红注射液对其的干预作用。方法 体外培养大鼠皮质神经元，神经元特异性烯醇酶（NSE）鉴定神经元纯度。建立体外培养大鼠皮质神经元模拟缺血再灌注模型，随机分为对照组（始终正常培养）、缺血再灌注组（体外模拟缺血再灌注）、治疗组（缺血再灌注加丹红注射液干预），应用免疫组织化学、免疫荧光染色方法鉴定神经元纯度；流式细胞术Annexin V、PI双标检测神经元凋亡率及活性半胱天冬酶(Caspase)3、Caspase8、Caspase9蛋白表达；ethods Rat cortical neurons munohistological staining and immunofluorescence staining. Neuronal ischemia/reperfusion models in vitro ia for 6 h in Earle’s ber osphere of 0.05 CO2, 0.95 N2 at 37 ℃, reperfusion ed by removing neuronal culture the anaerobic chamber and adding normal medium to an incubator osphere of 0.05 CO2、 0.95 air at 37 ℃. Percentage of apoptotic cells and expression levels of active Caspase3,9,8 ined by floetric analysis. Protein levels of GRP78, Bcl2, Cyt C and active Caspase12 munoblotting. Results The apoptosis rate induced after reperfusion 24 h and 48 h L/L) respectively (χ2=7.164,10.650;P 0.05). Protein levels of GRP78 and Caspase12 in cortical neurons in response to ischemia 6 h and reperfusion 24 h or 48 h ia/reperfusion but the released of cytochromec ia/reperfusion in vitro. Danhong injection can inhibit apoptosis caused by analogous ischemia/reperfusion (IS/RE) in vitro in rat cortical neurons. ［KEY ed Systems公司；AntiCaspase12、AntiGRP78多克隆抗体分别购自Stressgen公司；Active Caspase3、Caspase9、 Caspase8试剂盒购自BioVision公司；Bcl2、细胞色素C试剂盒购自Santa Cruz Biotechnology公司；NSE组化检测试剂盒购自北京中山公司；其他试剂均为市售分析纯。CO2恒温细胞培养箱(Napco 5410220， USA)；荧光倒置显微镜（Olympus， JAPAN)；全自动酶标分析仪 (Thermo Electron Corporation Multiskan MK3， USA)；流式细胞仪（FACSCLSR，BectonDickton，USA)；激光扫描共聚焦显微镜(Olympus Fluovieaging System，日本Olympus公司)。 1.2 方法 1.2.1 皮质神经元培养与鉴定 取出生24 h以内SD大鼠皮质于冷解剖液（4 ℃）中，剥离脑膜、血管，将脑组织剪成小于1 mm×1 mm×1 mm 的组织块,37 ℃水浴消化20 min, 加种植培养液(DMEM 中添加体积分数0.10胎牛血清及体积分数0.10马血清，pH 7.2～7.4) 终止消化并吹打,细胞悬液经200目滤网过滤,获得单细胞悬液，将1×106个细胞接种于预先包被多聚赖氨酸的35 cm培养皿。第2天更换维持培养液（Neuronbasal加体积分数0.02 B27），培养3～5 d半量换液，7～10 d用于实验。NSE免疫组织化学染色和IgG 免疫荧光染色(FITC 标记的兔抗鼠IgG 1∶200稀释) 鉴定神经元。 1