流式细胞仪培训_培训课件.ppt

流式细胞仪的临床应用 HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病 补偿调整实验 藻类细胞绝对计数 细胞周期分析 DNA含量分析-PI染色 细胞凋亡 细胞膜分析-PS外翻 PS（磷脂酰丝氨酸）正常暴露在胞膜的内表面，凋亡时，PS外翻向细胞外表面。重组蛋白Annexin-V可与PS结合 细胞凋亡 细胞生理学研究 Ca2+流动性检测 Ca2+ 是非常重要的细胞内离子，在胞膜到胞浆的信号转导中起重要的作用。细胞受到刺激后，胞内Ca2+浓度会发生改变。 最常用的染料 Indo-1 excited at UV Fluo-3 excited at 488nm Fura red excited at 488nm 细胞生理学研究 细胞活性分析 Fluorescein Diacetate进入活细胞后,被胞内酯酶降解,生成荧光底物.活细胞会发绿色荧光 细胞生理学研究 细胞膜电位的改变 超极化的细胞摄取更多的染料，细胞总的荧光强度增大；细胞去极化时，染料释放到细胞外，总的荧光强度减少。 染料和试剂 DiOC6(3) DiOC5(3) DiOC1(3) DiOC1(5) Valinomycin Gramicidin D CCCP 细胞内标记 胞内多种肽类已被成功标记，包括病毒颗粒、免疫球蛋白、雌激素受体、细胞因子、特殊蛋白如Bcl-2和cyclooxygenase. 胞内细胞因子 磷酸化蛋白 流式细胞仪原理与应用 陈玉婵 提 要 流式细胞仪简介 流式细胞仪工作原理 流式实验流程 流式细胞术的应用 流式细胞术的发展史 1930s~1950s:开始出现自动细胞分析技术（细胞的计数，是通过光电仪记录流过一根毛细管的细胞,用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白，应用分层鞘流原理，成功的设计红细胞光学自动计数器。） 1960s晚期发展：荧光检测细胞计 、细胞分选器检测细胞的荧光信号 、单克隆抗体技术 1973年，BD公司与美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪FACS I。 什么是流式细胞仪？ 在流动的状态中检测细胞各种物理及生物特征的一种仪器 仪器特点：单个细胞通过狭窄激光束，产生能够反映细胞大小的信号，激光束激发不同的荧光素所标记的细胞成分能发射出不同的荧光。 Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid 流式细胞仪的检测对象 藻类细胞 染色体 血细胞 原生动物细胞 任何存在于悬液中的直径为0.2-50微米的粒子或细胞都适用于流式分析 流式细胞仪工作原理示意图 流式的基本组成： 1.流动室和 液流系统 2.光路系统 3.电系统 流式细胞仪可提供的信息 物理信息：通过散射光信号反映 相对细胞大小 相对细胞颗粒密度和内部复杂度 荧光信息：通过荧光强度反映 散射光信号的产生 488nm激光产生散射光 1. 散射光信号 前向角散射光（FSC,Forward Scatter） 入射激光的同向散射光信号 反映细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（SSC, Side Scatter） 入射激光90?角的散射光信号 反映细胞粒度及细胞内相对复杂性 散射光 散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异 通常使用“散点图”来看散射光信号 散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据 利用散射光信号对混合细胞分群 2. 荧光信号 荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强 荧光信号的表示方法 双参数点图 单参数直方图 一个完整流式实验的组成 样品的处理 调整仪器条件 数据处理 1.样品处理 单细胞悬液的制备 浓度5?105?1 ?106/mL 外周血、骨髓、培养细胞、组织(经尼龙网300目过滤) 制成单细胞悬液 选择合适的荧光染料染色 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发 激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内 荧光素光谱的重叠应当尽量减少 2.仪器条件的确定 电压 阈值 荧光补偿（多色分析） 处在液流中的粒子通过激光束时产生光信号，这些光信号通过光电探测器转换成电信号（电压）。调整电压，可使信号强度改变。 BD流式细胞仪有两种类型的光电探测器：光电二极管和光电倍增管（PMTs）。