溶氧对发酵的影响.docxVIP

溶氧对氨基酸发酵的影响 [摘要] 溶氧(Dissolved Oxygen,DO)是氨基酸发酵过程中重要的限制因素之一。溶氧浓度会严重影响菌体的代谢去路。较高浓度的氧能为菌体提供足够的能量，有利于前期菌体的大量繁殖，从而为后期生产积累做好准备。然而过高的溶氧易产生羟自由基，超氧根负离子等活性氧，抑制菌体的生长，甚至使菌体自溶；同时，高溶氧浓度易导致代谢分流，产生副产物甚至有害杂质，不利于后期的产物的积累和分离。低的溶氧会抑制菌体生长，当溶氧过低（低于临界溶氧浓度）时，菌体也会发生自溶现象。同时，低的菌体浓度不利与后期的发酵产酸。不同阶段菌体的耗氧量也不经相同，所以研究溶氧的控制对发酵的影响具有重要意义。本文主要以苏氨酸和异亮氨酸发酵中的溶氧控制研究为例，介绍一些溶氧控制的方法及其对生产的影响。 关键词：氨基酸发酵 溶氧控制 苏氨酸 异亮氨酸 拟稳态 分阶段控制模式 代谢流 1.苏氨酸发酵的溶氧控制 1.1溶氧浓度的影响 徐庆阳等通过对L-苏氨酸生产菌TRFC发酵产苏氨酸的研究发现，只有提供高于临界氧浓度（20%）以上的溶氧菌体生长和产酸才能取得较好的效果。充足的供氧使菌体呼吸旺盛，能保持较快的生长速率。但氧浓度过高时，又会产生活性氧破坏细胞组分，影响细胞代谢，并易产生杂质。然而当溶氧过低时，菌体的生长受限，镜检发现有少量细胞碎片，说明长时间的低氧水平（5%）导致部分菌体自溶。通过实验摸索出分阶段的控制模式:在延滞期维持20%溶氧，在对数期后维持50%溶氧，稳定期恢复至20%溶氧更有利于菌体的生长及产物的合成。用上述方法控制溶氧，在10L罐补料分批发酵36h,产酸可达118.9g/L，糖转化率为47.6%。 1.2溶氧振荡控制研究 然而微生物培养过程中普遍存在明显的振荡等非线性现象。实际上，由于细胞代谢状态不断受到内外环境因素的影响，细胞的代谢水平和代谢物的组成始终处在动态变化中，因此需要合理的反馈调控机制才能实现发酵过程中的代谢平衡，以持续地提高发酵产率。徐庆阳等又以L-苏氨酸的溶氧强制振荡发酵为对象，考察了在溶氧强制振荡发酵条件下各种产物和副产物的生物合成规律，为菌种的???良和发酵控制以及发酵器设计提供参考。 他们设计了新的振荡发酵方式。溶氧振荡模式如下：在发酵前期Ⅰ(0~7 h)，溶氧浓度以每小时下降10%的速度下降至25%，进行阶梯式振荡；发酵中前期Ⅱ(7~12.5 h)， 溶氧浓度在20%；发酵中期Ⅲ(12.5~23 h)溶氧浓度在50%；发酵后期Ⅳ(23~36 h)溶氧控制在20%进行周期振荡，振幅为5%，振荡周期为1 h(图2a)。流加葡萄糖模式为：发酵12 h 后通过脉冲流加的方式继续流加葡萄糖(图2b)，使残糖浓度控制在15g/L左右。 大肠杆菌经过种子培养进入发酵后以溶氧强制振荡模式进行培养，细胞生长进入对数期相对非振荡培养模式较慢，培养12小时检出乙酸，此后缓慢增长，最大值为0.8g/L;而对照组产乙酸较先,且增速较快，很快达到最大值1.8g/L，此值已介于抑制浓度1.5-2.0g/L,对菌体有较强的抑制作用。但前者则不会。另外，溶氧强制振荡培养的最大生物量达29.5g/L也较对照组的22.5g/L为高。（如左图）这些都为发酵产酸打下了良好条件。其原因可能是强制振荡模式下细胞可以充分利用基质中的葡萄糖，有利于协调葡萄糖的摄入能力强于TCA循环周转能力滴的矛盾，防止代谢一流带来的乙酸过量合成，从而有利于生物量的增加和产物的合成积累。 另外，培养液中乙酸的过量积累将直接导致丙氨酸、分支链氨酸和芳香族氨基酸等福常务的合成，从而是目的产物L-苏氨酸的生物合成收到影响。发酵中的主要副产氨基酸是丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）和亮氨酸（Leu）。其质量浓度在不同控制模式下的变化如下图： 从图4可以看出，副产物丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸的合成在非强制振荡模式下较强制振荡模式下的高出许多。而36 h 目的产物苏氨酸的质量浓度为39.5 g/L，仅是强制振荡118.9 g/L 的1/3。也充分证明了溶氧强制振荡培养模式的优势。 1.3溶氧强制振荡模式对代谢流分布的影响 测定发酵后期的一个振荡周期(30 h 至 31 h)和非强制振荡在此阶段发酵液的缬氨酸、亮氨酸、苏氨酸、葡萄糖、丙氨酸及乙酸的胞外浓度，计算各自的积累或消耗速率如表1 所示。 用基于拟稳态假设基础上的分析方法做进一步分析发现：溶氧强制振荡(图5b)与非强制振荡模式(图5a)比较，在Glc6P 节点处通往HMP 途径的代谢流量由6.5 提高至95.88，而流向6-磷酸果糖代谢流量从93.5 降至4.1；在PEP 节点处，通过提供苏氨酸前体物草酰乙酸的CO 应代谢流量由45.1 提高至86.1，相应的从PEP 流向Pyr 的流量从152.7 降至81.9；从EM