五灵胶囊对LPS诱导枯否细胞释放细胞因子的影响论文.docVIP

　　五灵胶囊对LPS诱导枯否细胞释放细胞因子的影响论文 王胜春，张英志，胡咏武，李晓玮，田卫斌 【关键词】 ,五灵胶囊 【Abstract】 AIM: To investigate the effects of ETHODS: Hepatocyte and Kupffer’s cells rat livers and then exposed to LPS and DGlan. The changes of hepatocytes and cytokines secreted from Kupffer’s cells ined in the presence of EM F12培养基（批号：1095578，USA.Gibco公司）；新生牛血清（NBS）（杭州四季青，批号：200206112，用前灭活56℃，30 min）；脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）(USA.Sigma公司)；丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDHL）试剂盒（北京中生北控生物科技股份有限公司）；单胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）、丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）、谷胱甘肽S转移酶（glutathione stransferase，GSHST）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor，TNFα）、白细胞介素6（interleukin 6，IL6）、白细胞介素8（interleukin 8, IL8）试剂盒（北京北方生物技术研究所）；Raabit antiCD14，Raabit antiTNFα（武汉博士德生物工程有限公司）；五灵胶囊（西京医院制剂室生产，批号；1252型紫外分光光度计（日本岛津）；BB16/贺利气体培养箱（德国HERAEUS公司）. 1.2方法 1.2.1供试液的制备1640维持液：取灭活小牛血清10 mL加RPMI 1640 90 mL，即得；1640生长液：取灭活小牛血清20 mL加RPMI 1640 80 mL，即得；DMEM维持液：取灭活小牛血清10 mL加DMEM F12 90 mL，即得；DMEM生长液：取灭活小牛血清20 mL加DMEM F12 80 mL，即得；LPS贮备液：精密称取LPS 1.0 mg，加1640 DMEM维持液溶解至10 mL，微孔滤膜除菌，-20℃冷藏，备用；20 μg/L LPS供试液：取LPS贮备液加DMEM维持液稀释至20 μg/L，临用现配；60 μg/L LPS供试液：取LPS贮备液加混合液（肝细胞培养上清和1640维持液1∶1混合）稀释至60 μg/L，临用现配；0.5 mmol/L DGlaN供试液：精密称取DGlaN 5.38 mg，加DMEM维持液10 mL，微孔滤膜除菌，-20℃冷藏，用时加DMEM维持液稀释至50 mL；五灵胶囊供试液：取五灵胶囊内容物20 g，加乙醇150 mL回流提取1 h，滤过，减压回收乙醇，残渣加DMSO溶解制成1.0 kg/L（以药粉计）的贮备液，微孔滤膜除菌过滤（0.22~0.45 μm），用时取1.0 kg/L的贮备液加DMEM维持液稀释至终浓度为（4, 3, 2 g/L）为肝细胞受试药物；另取1 g/L的贮备液加1640维持液稀释至终浓度为（0.2, 0.1 g/L）为KC细胞受试药物. 1.2.2大鼠原代肝细胞分离与药效试验取12 L麻醉(250 mg/L, ip)，按文献［4］操作制备原代肝细胞，肝细胞重悬于DMEM生长液中，调整细胞密度为2×108个细胞/L，接种于24孔培养板内，置37℃ 50 mL/L CO2孵箱内培养48 h后，吸弃培养液；加4，2 g/L浓度五灵胶囊与肝细胞培养32 h,台盼蓝拒染试验和MTT活性试验检测受试药物对细胞毒性的影响,.freel 0.550～0.650，进行试验. ① 肝细胞修复试验：取培养板内细胞分为：正常组、DGlaN（或LPS）,五灵胶囊4, 3和2 g/L组，正常组每孔加DMEM维持液；DGlaN, LPS 2种损伤组与五灵胶囊3个剂量组分别加0.5 mmol/L DGlaN, 20 μg/L LPS供试液培养24 h，每组每剂量，1 mL/孔(n=8)，吸弃培养上清；正常组、DGlaN与LPS 2种损伤组加DMEM维持液，五灵胶囊3个剂量组加相应的剂量供试液1 mL/孔，继续培养24 h，收集培养上清，测定ALT, MAO, LDHL, GSHST和MDA; ② 肝细胞保护试验：另取肝细胞置24孔板内培养、分组同上，正常组和DGlaN, LP