人MUC┐1全长cDNA基因真核表达载体构建及在COS┐7细胞中的表达论文.docVIP

　　人MUC┐1全长cDNA基因真核表达载体构建及在COS┐7细胞中的表达论文 .freelanfulllengthMUC1geneandtodetectitsexpressioninCOS-7cells.METHODS TheMUC1gene-munoflourescenceandFCMidcontainedthecodingregionofhumanfulllengthMUC1gene.TransfectionexperimentverifiedthatMUC1genecouldbeexpressedinCOS-7cells.CONCLUSIONTheeu-karyoticexpressionvectorcontainingtheMUC1geneorphicepithelialmucin），该基因的一个重要特征是其多态性［1-3］（polymorphism），即其第2个外显子中含有可变数量串联重复序列（variablenumberoftandemre-peats，VNTRs），每个VNTR含有60个碱基，富含GC.不同人的VNTRs数量从20～125不等.正常情况下，MUC-1可表达于多种组织、器官中的上皮细胞.但研究［4-7］发现，MUC-1在乳腺癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌等多种肿瘤中异常表达，即表达量增高，且整个细胞表面均表达.由于糖基化不全出现新的抗原表位，是一种肿瘤相关抗原;同时，由于MUC-1是最先与机体免疫系统接触的细胞表面分子之一，肿瘤MUC-1可以非主要组织相容性复合体（MHC）限制性和MHC限制性方式活化杀伤性T淋巴细胞（CTLs），这些活化的CTLs可杀伤表达MUC-1的肿瘤细胞［8］.因此，MUC-1是肿瘤主动特异性免疫治疗理想的靶分子.为研究MUC-1肿瘤核酸疫苗的特异性抗肿瘤作用，我们构建了含人MUC-1全长cDNA序列的真核表达载体，并观察了该表达载体在COS-7细胞中的表达. 1材料和方法 1.1材料 1.1.1菌株、质粒及细胞系E.coliDH5α，pGEM-3zf（-）均由生物技术中心保存，MUC-1质粒（pVax-MUC-1，含32tandemrepeats）和真核表达载体pcDNA3.1（+）由英国ImperialCancerResearchFund的Taylor-Papadimitriou教授惠赠.COS-7细胞由本校生物化学和分子生物学教研室引进. 1.1.2工具酶及试剂限制性内切酶HindⅢ，SalⅠ，XhoⅠ购自Gibco公司;T4DNA连接酶购自TaKaRa公司;化学试剂均为国产分析纯.E.Z.N.ARplasmidMiniprepKit购自Omega公司;核酸凝胶纯化试剂盒NucleoTrapRGelExtractionKit购自Clontech公司;DMEM购自Gibco公司;MUC-1mAb为AntibodyDiagnostica公司产品;荧光抗体羊抗鼠IgG-FITC购自华美公司;小牛血清购自杭州四季清生物工程材料研究所. 1.2方法 1.2.1MUC-1基因克隆将质粒提取、酶切、连接及转化的主要方法均参照文献［9］进行.提取质粒pVax-MUC-1及pGEM-3zf（-）载体，分别经HindⅢ，XhoⅠ及HindⅢ，SalⅠ双酶切（SalⅠ与XholⅠ互补），NucleoTrapRGelExtractionKit回收3.5kbp的MUC-1DNA片段及pGEM-3zf（-），按DNA与载体3∶1比例于16℃连接过夜.取上述连接产物2μL转化感受态细胞DH5α，将转化后的DH5α涂布于含100mg L-1氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养.16h后挑取单克隆，提取质粒，经HindⅢ，XbaⅠ双酶切鉴定. 1.2.2DNA序列测定E.Z.N.ARplasmidMiniprepKit小量快速法提取重组质粒pGEM-3zf-MUC-1，用T7promoter引物和SP6引物从正反两向测序.DNA序列测定在博亚公司完成. 1.2.3真核表达载体的构建重组质粒pGEM-3zf-MUC-1测序正确后，将双酶切回收之MUC-1目的基因，与预先经HindⅢ和XhoⅠ双酶切的pcD-NA3.1（+）载体进行连接反应.以连接反应液转化感受态DH5α，挑选10个转化菌落，小量法提取质粒，进行酶切鉴定.阳性重组子命名为pcDNA3.1（+）-MUC-1. 1.2.4细胞培养COS-7细胞用含100mL L-1FCS的DMEM培养于100mL细胞培养瓶，约75%长满，10g L-1胰酶加2g L-1EDTA消化后，2000r min-1离心10min，收集细胞，用少量1×PBS液重悬，调整细胞数至2×1010个 L-1. 1.2.5质粒