人RHD基因结构研究及意义论文.docVIP

　　人RHD基因结构研究及意义论文 者：周华友，兰炯采，王晓珠，樊红，孟庆宝，张印则，王从容 【关键词】 聚合酶链反应 【Abstract】 AIM: To analyze structure of RHD gene, emphasizing on detecting promoter of RHD gene, and to investigate mechanism of RHD expressing. METHODS: 60 samples of unrelated RhD(+) Hans, 98 samples of RhD(-) Hans and 2 samples of ers. RESULTS: Promoters of individuals oters of the RhDnegative individuals carrying the partial or intact RHD gene echanism of RHD negative , and there may exist another mechanism of RhD negative in individuals oter regions (geics); polymerase chain reaction sequence analysis; DNA primers; phenotype; genotype 【摘要】 目的： 研究RHD基因结构，重点检测启动子区.freeletra T1型PCR扩增仪和Biometra恒温恒压电泳仪，SYNGENE公司产Gene Genius 型凝胶成像系统. 1.2方法 1.2.1RhD表型检测聚凝胺法检测RhD表型，抗D试剂为美国Immuncor公司和Domining生物公司的单克隆和多克隆抗血清. 聚凝胺法RhD阴性样本用改良抗人球蛋白实验确认. 改良抗人球蛋白实验RhD阴性样本用三氯甲烷/三氯乙烯做吸收放散试验 ,以确定是否为Del型(Absorption/elution, Del型). 1.2.2基因组 DNA的制备使用美国 G T公司基因组 DNA快速抽提试剂盒 ,采用盐析法从供血者外周血分离获得: 0.3 mL EDTA抗凝外周血加1 mL红细胞裂解液 ,离心弃上清 ,沉淀加入170 μL核裂解液及 4 μL SDS,剧烈振荡 ,再加入 72 μL 5 mol/ L NaCl溶液 ,.freelin,取上清加入 210 μL异丙醇沉淀 DNA,将 DNA溶于 50～100 μL TE溶液中,4℃保存待用. 1.2.3RHD基因结构区PCRSSP法检测启动子区检测： 12.5 μL PCR反应体系组成： 50～200 ng基因组DNA，1×Buffer(50 mmol/L KCl, pH 8.0的10 mmol/L TrisHCl)，1.5 mmol/L MgCl2, 200 μmol/L dNTPs，检测引物浓度0.2 μmol/L，以扩增人生长激素基因（HGH）一段434 bp产物作为内对照，内对照引物浓度0.08 μmol/L，8.335 nkat Taq DNA聚合酶. 循环参数： 95℃预变性5 min，然后30个循环：94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 30 s, 最后72℃延伸5 min，4℃保存. 电泳： 20 g/L琼脂糖凝胶（含0.5 mg溴化乙锭 / L胶），10 μL PCR扩增产物点样，5～8 V/cm 电压电泳30 min，凝胶成像. 引物序列见Tab 1.表1RHD基因启动子区PCRSSP方法所用引物序列（略） 2结果 10份RHD+/RHD+型标准DNA检出上、下游Rhesus盒，无杂合Rhesus盒，即RHD基因双基因型，10份RHD+/RHD-型标准DNA检出上、下游Rhesus盒和杂合Rhesus盒，即RHD基因单基因型，10份RHD-/RHD-型标准DNA只检出杂合Rhesus盒无上、下游Rhesus盒，即RHD基因全缺失型，以上结果与标准品型别一致(Fig 1). 98例无血源关系RhD(-)汉族人样本中54例（55.1%）只检出杂合Rhesus盒无上、下游Rhesus盒（RHD-/RHD-型），即RHD基因全缺失型，36例（36.7%）同时检出上、下游和杂合Rhesus盒（RHD+/RHD-型），即RHD基因单基因型，8例（8.2%）只检出上、下游Rhesus盒无杂合Rhesus盒（RHD+/RHD+型），即RHD基因双基因型. 在98例RhD阴性样本中检出16例Del型，这16例Del型中10例（62.5%）同时检出上、下游和杂合Rhesus盒（RHD+/RHD-型），6例（37.5%）只检出上