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sPLA - ⅡA 慢病毒在人单核细胞中的表达及致动脉粥样硬化作用 2 中文摘要 研究背景 动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS ）是威胁人类健康的主要疾病之一，对于 动脉粥样硬化机制的研究一直是心血管疾病研究领域的热点。由于动脉粥样硬化 的发病过程十分复杂，目前其发病机制尚未完全阐明。近年的研究表明，动脉粥 [1] 样硬化是一种特殊的炎症反应，“炎症诱发的内皮损伤-反应学说” 得到了广 泛的认可。 分泌型磷脂酶 A -IIA （secretory phospholipase A of group IIA ，sPLA -IIA ） 2 2 2 参与了动脉粥样硬化过程。炎症反应是动脉粥样硬化的主要特征，其参与了富含 脂质的粥样硬化斑块的形成、进展以及破裂过程，在此过程中释放了大量的 [2] [3] [4] sPLA -IIA 。sPLA -IIA 为分泌型磷脂酶 A 的亚型 之一，主要由血管壁平滑 2 2 2 肌细胞与巨噬细胞等产生，属于钙依赖的磷脂酶家族，主要位于巨噬细胞集聚区、 [5] 脂质核心区以及病变内膜的细胞外基质内。研究表明 ，sPLA -IIA 通过影响细 2 胞的脂质代谢，水解动脉内膜中含有载脂蛋白 B-100 的磷脂分子，生成游离脂肪 酸和溶血磷脂，这些产物可以作为细胞内的第二信使或进一步成为炎性介质，从 而具有促动脉粥样硬化的作用。 目的 利用基因体外合成技术，全基因合成人分泌型磷脂酶 A2-IIA 基因片段，构 建含人 sPLA2- ⅡA 基因的慢病毒载体，转染人单核细胞，并研究其在单核细胞 中的过表达及致动脉粥样硬化炎症作用。 方法 根据 Gene Bank 中 sPLA - ⅡA 的基因序列，全基因合成人 sPLA - ⅡA 基因 2 2 片段，构建含 sPLA2-IIA 基因的慢病毒载体。体外培养人单核细胞（THP-1 ），将 慢病毒载体转染人单核细胞，于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，分别收 集 sPLA - ⅡA 和空病毒转染后 72h 的单核细胞，提取mRNA ，逆转录为 cDNA， 2 进行 Real-time PCR 方法检测 sPLA - ⅡA mRNA 表达水平与炎症因子单核细胞趋 2 化蛋白-1 （MCP-1 ）和细胞间粘附分子-1 （ICAM-1 ）mRNA 的表达水平。所有 数据资料用 SPSS13.0 软件包行统计学处理。P0.05 为差异有统计学意义， 4 P0.01为差异有显著统计学意义。 结果 1. 扩增出人 sPLA - ⅡA 基因片段，构建含人 sPLA - ⅡA 基因的慢病毒载体。 2 2 测序表明构建的 sPLA - ⅡA 慢病毒准确； 2 2. 体外培养人单核细胞，细胞生长状态良好，慢病毒转染人单核细胞，荧 光显微镜下观察发现绿色荧光蛋白的表达，表明慢病毒转染真核细胞成功； 3. 利用 Real-time PCR 方法检测 mRNA 表达水平，发现与空病毒对照组相 比，含有目的基因的细胞其 sPLA - ⅡA mRNA 表达水平及炎症因子单