Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D的表达、纯化、结晶以及结构解析.pdf

摘要 疱疹病毒是一种常见病原微生物，在 自然界中能感染众多宿主。单纯疱疹病毒 （Herpes simplex virus type，  HSV）是疱疹病毒科 α 亚科，其复制周期短，繁殖 速度快。根据血清型分类，HSV 分为两个种类，分别是 I 型单纯疱疹病毒（HSV­1） 和 II 型单纯疱疹病毒（HSV­2）。HSV­1 易感染人的口腔以及眼上皮细胞，导致口腔 疱疹、单纯疱疹病毒性角膜炎等疾病。HSV­2 则主要感染人的生殖系统，引起生殖器 疱疹。该性病的发病率仅次于淋病和梅毒。HSV­1和 HSV­2均能潜伏感染神经细胞。 不论是 HSV­1还是 HSV­2，单纯疱疹病毒感染细胞都离不开三个过程：粘附、受 体结合、融合。在这三个过程中，HSV 囊膜上的糖蛋白起到了重要作用。gC 和 gB  与受体结合后使得病毒的囊膜和细胞的脂质膜靠近，从而病毒粘附在细胞上。gD 与  nectin­1/nectin­2、HVEM、3­O­硫酸乙酰肝素、gB 与 PILRα、Non­muscle myosin IIA  进行受体识别和结合。之后形成的 gD、gB、gH 和 gL 的四元复合物引发膜融合。 其中 gD在病毒与宿主细胞的膜融合过程中作用关键。 根据已经解析的 HSV­1 gD  以及其与受体 HVEM 的复合体的结构发现，gD 的 C 端回折缠绕在 N 端的受体结合 位点，但当受体结合时，C 端让出该结合位点。而 C 端与 gB、gH 和 gL 形成融合符 合物。 由于HSV­1 和 HSV­2 二者感染的细胞不同， 并且不同株系病毒的囊膜蛋白 gD选 择的受体也有所不同。为了了解 HSV­1 gD和 HSV­2 gD在受体选择上的差异，需要 进一步研究这两种蛋白与其受体结合的细节。而 目前所得到的  gD  蛋白结构仅是  HSV­1 KOS株的gD （1­259）、（1­306）以及与 HVEM 的复合物结构，并没有 HSV­2  gD 的结构。 故在本文中利用杆状病毒表达系统表达出 HSV­2 stain333 的gD 蛋白的胞外部分 区域（1­285aa），经过 Ni­NTA  亲和层析以及分子排阻层析纯化后，浓缩至  5mg/ml  和 10mg/ml，进行悬滴气相扩散法筛选蛋白晶体的生长条件，并得到初筛的晶体。在 初筛的晶体生长条件下进行优化。优化后的晶体生长条件为 0.1M  Hepes pH7.2,  5%  o  (v/v) MPD，10% PEG10000，18 C。经过 X­射线衍射后，得到了分辨率为 1.8 Å 的一 套晶体衍射数据。分析后的数据显示晶体属于 P21 空间群，晶胞参数为 a = 63.6, b =  55.4, c =65.3 Å, β = 96.3°。 关键词：II 型疱疹病毒 病毒入侵机制  gD  受体结合 杆状病毒表达系统 晶体结构 I  Abstract  Herpes Virus is a common pathogenic agent which can infect many hosts in the world.  Herpes simplex virus (HSV) is a member of the alphaherpesvirus subfamily, and the speed  of the virus’applification in this subfamily is very fast. According to the difference in the  serotype, Herpes simplex virus has two members: HSV­1 and HSV­2. HSV­1 infection in  oral Epithelium cell and the eye results in herpes of mouth, herpetic keratitis and so on.  However, HSV­2 infects genital cell and causes genital herpes. After initial infection, both