【2017年整理】流式与细胞仪及其应用指南：flowcytometryapplicationguide.ppt.ppt

流式细胞仪标本处理一般原则及方法;双光源系统流式细胞仪;;在管道大约50倍直径距离处，鞘液中心速度与边缘速度达到稳定，形成稳定的层流。;无论每秒检测数量为多少，颗粒经过检测区的速度是衡定的;;流式细胞仪标本准备 染色的一般原则及方法;标本来源： 外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他。;标本处理时间：;样本处理标准试剂：;二、0.1% BSA-PBS缓冲液;方法一：溶血法;注：化学试剂直接作用于红细胞的溶血剂有：以草酸为主的溶血剂（Coulter Q-Prep），基于NH4CL的BD公司的FACSLyse溶血剂。;方法二：密度离心法提取单个核细胞; 1. 准备2ml抗凝血（根据实验要求确定用血量）， 等量PBS稀释； ; 淋巴节、扁桃体、脾、胸腺等淋巴组织由于结构松散，容易分离成单个细胞。一般对样本进行切剪、研磨、过滤便可。;其他标本：通常在其他组织中分离淋巴细胞???用酶进行消化。对于不同标本，处理方法也各不相同。;方 法：;其他类型细胞;材 料; 将样本置于皮氏培养皿，加15ml BSA-PBS，将样本切 成1mm3大小，用镊子将其分离； HBSS或PBS洗清 加入10ml无Ca、Mg离子0.2% II型胶原酶溶液0.02% DNase 1的HBSS； 37oC摇床上孵育15~60分钟，视样本类型而定； ;用5ml的吸样管反复吹打，制成单个细胞悬液； 使用35um滤网过滤，300g离心5分钟； 用PBS或细胞培养液重悬样本；对于某些样本过滤后仍有小块组织，重复第5步获取细胞，重复第7步； 用含0.15%胰酶、0.02%DNase 1不含Ca、Mg的HBSS重悬， 37oC孵育一段时间加入1%BSA或5%FBS，灭活酶活性。 ;细胞培养;样 本 处 理;抗体染色一般方法;细胞计数方法;反应体积;抗体染色;SPECIFIC ANTIBODY;流式细胞仪抗体滴定方法;6;孵育、溶血、固定;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;白细胞保护型溶血剂Cal-Lyse(其中已含细胞固定剂)：;各溶血剂性能比较;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;抗体标记荧光素及其他荧光染料;标记抗体常用荧光素 FITC;PE;PE-Cy5 TC;PE-Cy7;APC;核酸染料;细胞膜电位、离子、脂类探针;与流式细胞仪相关的荧光术语;第二部分;上机检测;技巧一：定位目标细胞群体;技巧二：阴性对照;技巧三：常见故障及解决;技巧四：检测指标;荧光补偿：极其重要的操作;FITC与PE;调与未调补偿;补偿调节原理;补偿调节原理;双色荧光补偿调节标准方法：第一步;双色荧光补偿调节标准方法：第二步;双色荧光补偿调节标准方法：第三步;因为：;所以：;注意！;复杂方案分析;流式细胞仪CD34阳性干细胞计数标准方案：ISHAGE;CD34计数中的问题;第一步;第二步;第三步;第四步;第五步;第六步;第七步;阴性对照;流式细胞仪数据保存及分析;功能强大的免费分析软件：PC版;临床流式细胞仪应用简介;DNA倍体分析：DNA分析是流式细胞仪最初且是现在应用最广检测项目。由于恶性细胞DNA含量通常与正常细胞不同，存在异倍体细胞，所以现有很研究评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系。DNA含量检测还可提供细胞周期方面的信息，这在细胞生物学中运用很广泛。特别地，它可表示出细胞毒性药物对细胞作用过程。这些DNA检测还可与细胞表面标志物标记同时进行，这样在细胞混合培养中，可通常追踪表达特异标志物的细胞显示其生长周期情况。 所有方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光，常用的染料为PI，DAPI。 流式细胞仪要求：488nm光源，575nm滤光片。 ;;DNA倍体的诊断标准;细胞生存能力实验，使用Heochest 33342染料与DNA特异性结合，后因细胞活力不同染料的结合程度也各异，故可评估细胞的活性度。 流式细胞仪要求：360nm光源，455nm滤光片 计数外周血中检