11酶的定向催化.pptVIP

Directed enzyme evolution;一、自然进化与定向进化;2、定向进化;3、定向进化的一般过程;4、酶定向进化的意义;二、酶分子定向进化的历史;1981年，B.G.Hall等定向改变E.coliK12中ebg酶的底物专一性，开发出对几种糖苷键有水解能力的酶。 1993年，Arnold研究组提出易错PCR的方法。 1994年，Stemmer将DNA重组方法引用到酶分子的定向进化中。 1999年，Stemmer等把DNA改组延伸到族改组。;三、酶分子的定向进化;1、定向进化的过程;2、多样性的产生;（1）易错 PCR(error-prone PCR);（2）连续易错 PCR(Sequential error-prone PCR);（3）DNA改组技术(DNA shuffling);（a)单个基因的DNA改组;DNA改组与常规定向进化的比较;（b) 基因家族改组技术(family shuffling);(c ) DNA改组原理;（d）随机引物体外重组法(RPR);（e）交错延伸原理;采用基因家族的改组效果明显高于单个基因的改组效果。 特点：改组基因的效率高；提高基因突变机率。 ;五、基???文库的构建;2、突变体基因的构建策略;3、构建突变基因文库的载体系统;（2）质粒载体系统 载体选择 基因重组 组装突变基因文库。 体外操作简便，载体本身的设计上有很大可塑性； 最大优点是能实现对基因文库的功能性筛选； 缺点是插入片段的载体容量较小，含有长片段的重组克隆在文库的群体扩增过程中容易丢失； 转化效率普遍较低； 不适合文库的长期保存。;4、文库的筛选;5、定向进化的筛选;6、高通量筛选技术;（2）酶活力检测;（3）噬菌体显示筛选模式;（4）pH指示剂显色高通量筛选;（5）产物显色筛选;（6）荧光产物筛选;（7）基于比色法和荧光检测的高通量筛选;六、酶定向进化技术应用