以GFP为标记的肝癌细胞RNA转染树突状细胞的体外效应论文.docVIP

　　以GFP为标记的肝癌细胞RNA转染树突状细胞的体外效应论文 张利旺，张红梅，刘文超，潘伯荣，斯晓明，任军 【关键词】 树突状细胞；绿色荧光蛋白；RNA；转染 Effect of dendritic cells transfected arker in vitro 【Abstract】 AIM: To investigate the feasibility of GFP as a marker to observe the dendritic cells (DCs) transfected or cells and the feasibility of the transfected DCs serving as a vaccine for potential immunotherapy. METHODS: Plasmid pGFPC3 the HepG2GFP using Trizol; DCs ononuclear cells (PBMCs), and transfected icroscope, the changes of phenotype etry, and the change of IL12 secretion in the supernatant of DCs icroscope, so did DCs transfected embrane molecules such as CD80 (13.2% to 86.7%), HLADR (38.9% to 97.9%), CD83 (0.9% to 97.1%), CD86 (31.2% to 92.5%) atically, IL12 secretion in the supernatant arker to observe the effect of transfection of DCs or cell RNA. DCs transfected or cell RNA may serve as a promising vaccine of immunotherapy. 【Keya, HCC)是一种常见的恶性肿瘤，适合手术治疗的患者只占一少部分，具有较高的复发率，预后很差，严重威胁人类健康［1］. DCs(dendritic cells, DCs)是体内功能强大的专职性抗原提呈细胞，它能够高效的摄取、处理抗原，并将处理后的多肽呈递给静息型T细胞，引起针对该抗原的特异性免疫反应［2］. 国内外类似的研究中，都没有明确的可以观察肿瘤RNA转染DCs效果的指标，我们应用绿色荧光蛋白质粒载体 pGFPC3稳定转染肝癌细胞HepG2，提取筛选后细胞HepG2GFP总RNA转染DCs，观察转染后DCs绿色荧光蛋白表达及特异性表面标志及功能相关分子表达，检测其上清细胞因子分泌，探讨其作为肿瘤疫苗的可行性. 1材料和方法 1.1材料肝癌患者外周血单个核细胞来源于我科造血干细胞移植患者；HepG2肝癌细胞株由我科常规传代培养. 流式细胞仪（BD），DG3022A型酶联免疫检测仪（华东电子管厂），荧光显微镜Optiphot XIF（Nicon）等均为我院常备. FITCCD80，FITCHLADR，PECD83，PECD86抗体购自BD公司；rhGMCSF，rhIL4购自Peprorotec公司；TNFα购自我校生物技术中心；绿色荧光蛋白载体pGFPC3由陕西省肿瘤医院贾军博士惠赠；脂质体Transfection2000，Trizol Reagent购自Invitrogen；RPMI 1640培养基、胎牛血清、G418购自Gibco公司，Xvivo无血清培养基购自BioTT购自Sigma公司. 1.2方法参照Transfection2000说明书，pGFPC3转染HepG2，G418筛选2 mon. 筛选细胞命名HepG2GFP，荧光显微镜下观察. Trizol试剂提取HepG2GFP总RNA，紫外灯下观察，-80℃冻存备用. 同样方法提取HepG2总RNA. 取肝癌患者造血干细胞分离液，贴壁法分离单核细胞，贴壁细胞在细胞因子rhGMCSF，rhIL4作用下，诱导DCs. 倒置显微镜、电子显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞表型. 1.2.1转染树突状细胞收集培养4 d的DCs，转入6孔板，转染HepG2GFP总RNA. 另设转染HepG2总RNA及空白对照组. 继续培养48 h. 荧光显微镜下观察. 1.2.2细胞因子分泌的测定48 h后，收集各组DCs上清，ELISA法检测转染前后各组细胞上清中IL12分泌量. 1.2.3CTL效应收集各组DCs，30 Gy 60Co照射后与复苏冻存的非贴壁细胞按20∶1比例混合接种于24孔板，培养5 d，收集